蛇膽菠蘿蛋白酶腸溶薄膜衣片質量標準研究

蔣偉杰，聶倩慶，陳小霞

（1.廣東省江門市新會人民醫院，廣東 江門 529100； 2.廣東省江門市新會區新城醫院，廣東 江門 529100；3.廣東藥學院，廣東 廣州 510006）

蛇膽菠蘿蛋白酶腸溶薄膜衣片為醫院制劑，主要成分有蛇膽汁、菠蘿蛋白酶，具有消除組織水腫、抗炎、化痰止咳等作用。為確保制劑療效，筆者參照文獻[1-4]建立了蛇膽汁的鑒別方法及菠蘿蛋白酶的活力測定方法，現報道如下。

1 儀器與試藥

78X-2型片劑四用測定儀（上海黃海藥檢儀器廠）；751GD型紫外分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；ZF-2型三用紫外儀（上海安亭電子儀器廠）。菠蘿蛋白酶（南寧市罐頭廠，效價800 U/mg）；蛇膽菠蘿蛋白酶腸溶薄膜衣片及陰性樣品（新會人民醫院自制）；蛇膽汁[新會人民醫院采制，蛇的品種有眼鏡蛇 Naja naja （L.），眼鏡王蛇 Ophiophagus Hannah，金環蛇 Bungarus fasciatus，銀環蛇 Bungarus multicintus Blyth，百花錦 Elaphe moellendorffi，三索蛇 Elaphe radiate，水律蛇 Ptyas mucosus，過樹榕蛇 Ptyas korross，烏梢蛇 Zaocys dhumnade（Cantor）等]；酪氨酸及酪蛋白（中國藥品生物制品檢定所）；硅膠G（青島海洋生物制品廠）；試劑為分析純，水為二次蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 樣品處方

每1 000片含蛇膽汁200 g，菠蘿蛋白酶10 000 kU（約12.5 g）。

2.2 陰性樣品及蛇膽汁制備

按處方制備不含蛇膽汁、菠蘿蛋白酶的片劑，得蛇膽汁及菠蘿蛋白酶的陰性樣品。取動物蛇的膽，保存于含乙醇50%以上的米酒中，蛇膽與酒的比例為 1∶1（g/g），用時除去膽衣，混勻即可[3]。

2.3 片劑通則檢查

片劑脆碎度：取樣品10片，置片劑四用測定儀（轉速25 r/min）中測定 4 min，取出，浸入鹽酸溶液（9→1 000）中，5 min后取出，用濾紙擦干，觀察片面，不得有滲水、溶脹、裂縫等現象。

崩解時限：在經脆碎度檢測的片劑中取6片，照2005年版《中國藥典（二部）》附錄方法測定[3]。先在鹽酸溶液（9→1 000）中檢查2 h，每片均不得有裂縫、崩解或軟化現象；用少量蒸餾水洗滌后，再在磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）中檢查，1 h內應全部崩解。

2.4 蛇膽汁薄層色譜鑒別[2，7]

取樣品1.5 g，加乙醇5 mL，攪勻，溫熱約1 h，振搖，濾過，濾液作為供試品溶液；同法制備陰性對照品溶液；另取蛇膽汁對照藥材，加乙醇制成5 g/L的溶液，作為對照藥材溶液；按2.5.1項下方法制備菠蘿蛋白酶對照品溶液。照薄層色譜法[2005年版《中國藥典（一部）》附錄Ⅵ B]試驗，吸取上述4種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以異戊醇-冰醋酸-水（9∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點（圖1）。

圖1 薄層色譜圖

2.5 菠蘿蛋白酶效價測定[1，5-6]

2.5.1 溶液制備

取鹽酸半胱氨酸5.27 g，加水500 mL溶解，另取乙二胺四醋酸二鈉2.23 g，加水200 mL溶解，合并兩液并混勻，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至4.5，加水稀釋至1 000 mL，即得鹽酸半胱氨酸緩沖液。取105℃下干燥至恒重的酪氨酸適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液制成質量濃度約50 μg/mL的酪氨酸對照品溶液。取硅膠干燥器中干燥至恒重的酪蛋白0.6 g，精密稱定，置燒杯中，加0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液80 mL，置65℃水浴溶解，放冷，用1 mol/L鹽酸溶液調pH至7.0，轉移到100 mL量瓶中，加水至刻度，作為底物溶液（用時現配）。取樣品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量（含菠蘿蛋白酶約50 kU），加少量鹽酸半胱氨酸緩沖液，攪拌并轉移至100 mL量瓶中，加鹽酸半胱氨酸緩沖液至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用鹽酸半胱氨酸緩沖液稀釋至刻度，即得供試品溶液。取三氯醋酸1.8 g、無水醋酸鈉2.99 g、冰醋酸液1.9 mL，用水溶解并稀釋至100 mL，即得三氯醋酸溶液。精密稱取菠蘿蛋白酶適量（約200 kU），加少量鹽酸半胱氨酸緩沖液，攪拌并轉移至100 mL量瓶中，加鹽酸半胱氨酸緩沖液至刻度，即得菠蘿蛋白酶對照品溶液。

2.5.2 測定方法

精密量取供試品溶液1.0 mL，置具塞試管（15 mm×130 mm）中，置37℃水浴預熱5 min，精密加入37.0℃預熱的底物溶液5.0 mL，立即振搖，置37℃水浴中準確反應10 min，加三氯醋酸溶液5.0 mL，振搖，置37℃水浴中準確放置40 min；用干燥濾紙濾過，取續濾液，照分光光度法[2005年版《中國藥典（二部）》附錄ⅣA]，以水為空白，在275 nm波長處測定吸光度 A；再精密量取供試品溶液1.0 mL，加三氯醋酸5.0 mL，振搖，精密加入底物溶液5.0 mL，同法操作，測定吸光度 A0；另取酪氨酸對照品溶液，以水為空白，在275 nm波長處測定吸光度 As。按下式計算標示量：標示量=（AA0）/As·Ws/W·11/10·n·平均片重 /平均標示量×100%。式中 n為供試品的稀釋倍數，W為供試品的取樣量，Ws為對照品溶液每1 mL中含酪氨酸的量。

2.5.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品溶液，分別配制成效價濃度為30，40，50，60，70 U/mL 的菠蘿蛋白酶測定液，分別取上述測定液并按2.5.2項下方法測定，以測定液效價濃度對測定效價值進行線性回歸，得回歸方程 Y=23.5 X+12.5，r=0.996 5（n=5）。結果表明，菠蘿蛋白酶測定液效價濃度在30～70 U/mL范圍內與效價值線性關系良好。

穩定性試驗：取供試品溶液，分別于0，1，2，3 h時測定效價。結果的 RSD=0.65%（n=4），表明供試品溶液在3 h內穩定。

干擾性試驗：取含蛇膽汁不含菠蘿蛋白酶的陰性樣品，依法測定。結果表明，陰性樣品不干擾測定。

回收率試驗：稱取陰性片劑粉末2.5 g（約10片），共6份，以2份為1組，分別精密加對照品溶液20，25，30 mL，相當于菠蘿蛋白酶為標示量的80%，100%，120%，置100 mL量瓶中，依法測定效價。結果見表1。

表1 菠蘿蛋白酶回收率試驗結果（n=6）

3 討論

蛇膽汁是本藥的主要成分之一，由于不同種屬的蛇的膽汁成分有很大差異，且無統一標準，筆者參照文獻[2，7]，以蛇膽汁作為對照藥材，對該藥蛇膽汁成分進行薄層析鑒別，該法簡易行。

菠蘿蛋白酶在胃液中易被破壞而失活，應制成腸溶衣片[4-6]。考慮到該藥品為腸溶薄膜衣片，為避免其腸溶衣在運輸和使用過程中摩擦受損，確保藥品療效，特設了片劑脆碎度檢查，并于測定后取樣進行崩解度檢查。效價測定[1，5]是將酪蛋白水解為酪氨酸，用紫外光譜法測定酪氨酸含量，從而計算酶的效價。在上述條件下，每分鐘水解酪蛋白生成與1 μg酪氨酸相當的菠蘿蛋白酶量為1活力單位，藥品效價應為標示量的85.0% ～120.0%。菠蘿蛋白酶不穩定，反應時間、溫度、濃度的影響相對較大[5-6]，故測定結果可能有偏差。本試驗證明，采用文中所述方法時，該藥的蛇膽汁及輔料等成分不干擾效價測定，結果偏差在可控范圍內，可作為標準依據。

重現性試驗：取同一批（批號為B01）樣品6份，分別精密稱定，依法制備供試品溶液并測定。結果每片平均效價相當于標示量的98.57%，RSD=0.64%（ n=6）。

2.5.4 樣品效價測定

依法測定了3批樣品，結果見表2。

表2 樣品效價測定結果（n=3）

[1]國家藥典委員會.國家藥品標準（第十六冊）[M].北京：人民衛生出版社，2003：128-129.

[2]康廷國.中成藥薄層色譜鑒別[M].北京：人民衛生出版社，1995：250-254.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業出版社，2005：附錄Ⅹ.

[4]陳新謙，金有豫，湯 光.新編藥物學[M].第16版.北京：人民衛生出版社，2007：694.

[5]章佩芬，郭 勇.菠蘿蛋白酶的保存穩定性研究[J].藥物生物技術，2002，9（3）：163-164.

[6]鄭 昆，隋 新，張曉杰，等.菠蘿蛋白酶提取的初步研究[J].吉林化工學院學報，2005，21（1）:17-18.

[7]謝志民，王敏春，王云霞，等.蛇膽川貝液中蛇膽汁鑒別方法的考察[J].中成藥，2003：25（7）：583-584.