高效液相色譜法測定婦樂顆粒中大黃素和大黃酚含量

盛 燕 ，汪培鈞 ，張文婷 ，陳 勇

（1.浙江省食品藥品檢驗所，浙江 杭州 310004； 2.杭州天目山藥業(yè)股份有限公司，浙江 臨安 311300）

婦樂顆粒處方由忍冬藤、大血藤、大黃（制）等10味中藥組成，具有清熱涼血、活血化瘀、消腫止痛的功效，用于急性盆腔炎、急性附件炎、急性子宮內(nèi)膜炎等婦科炎癥引起的帶下、腹痛。目前，國內(nèi)有6家企業(yè)生產(chǎn)該品種，臨床應(yīng)用廣泛。方中制大黃有瀉火解毒、逐瘀通經(jīng)等作用，大黃素、大黃酚為主要活性成分[1]。為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障用藥安全與有效，筆者參考有關(guān)文獻[2-3]，建立了同時測定婦樂顆粒中大黃素、大黃酚含量的高效液相色譜（HPLC）法，報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列液相色譜儀（自動進樣分析）。大黃素、大黃酚對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110756-200110，110796-200513，供含量測定用）；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純；婦樂顆粒（杭州天目山藥業(yè)股份有限公司，批號為 20061113，20061114，20061115）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Zorbax Extend C18柱 （250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.1%磷酸溶液（80 ∶20）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃ ；檢測波長：265 nm。在此條件下各組分分離良好，陰性對照品溶液對測定無干擾（圖1），理論塔板數(shù)以大黃素峰計算應(yīng)不低于8 000。

2.2 溶液制備

取大黃素、大黃酚對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL含 6 μg和10 μg的溶液，即得對照品溶液。取裝量差異項下的樣品，研細，取約0.3 g，精密稱定，置燒瓶中，加8%鹽酸溶液10 mL，再加三氯甲烷25 mL，加熱回流1 h，放冷，混合液移至分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入同一分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液用三氯甲烷振搖提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收三氯甲烷至干，殘渣加甲醇適量，微熱使溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取不含大黃的陰性樣品，同法制得陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取大黃素對照品（10.54 μg/mL）、大黃酚對照品（11.12 μg/mL）混合溶液 1，2，4，8，16，20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣量（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，回歸方程大黃素為 Y=4 606.6 X-4.613 7，r=0.999 9（n=6），結(jié)果顯示進樣量在0.010 54～0.210 80 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系；回歸方程大黃酚為 Y=6 083.4 X-6.716 8，r=1.000 0（n=6），結(jié)果顯示進樣量在 0.011 12 ～0.222 40 μg范圍內(nèi)與峰面積有良好線性關(guān)系。

精密度試驗：精密吸取同一供試品溶液，連續(xù)進樣。結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的 RSD分別為0.77%和0.50%（n=6）。

重現(xiàn)性試驗：精密稱取同一樣品6份，按供試品溶液制備方法制備并測定。結(jié)果大黃素的平均含量為106.67 μg/g，RSD=2.05%（n=6），大黃酚的平均含量為 161.72 μg/g，RSD=1.45%（n=6），總含量的平均含量為 268.39 μg/g，RSD=1.49%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，于 0，4，9，13，21 h 時分別進樣10 μL。結(jié)果大黃素、大黃酚峰面積的 RSD分別為0.53%和0.52%（n=5），表明供試品溶液在21 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗：精密稱取已知含量樣品6份，精密加入大黃素、大黃酚對照品適量，按供試品溶液制備方法制備，測定峰面積并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃素和大黃酚加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取樣品3批，依法制備供試品溶液并測定。結(jié)果3批樣品每袋含大黃以大黃素（C15H10O5）和大黃酚（C15H10O4）的總和計分別為1.56，1.58，1.59 mg（n=2）。

3 討論

方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法結(jié)果準確，重現(xiàn)性好，可有效地控制該制劑的質(zhì)量。

制備供試品溶液時，進行了提取方法的比較，結(jié)果采用水解中直接提取大黃素、大黃酚的方法，較藥典大黃含量測定項供試品前處理簡單，且效率相當(dāng)。試驗中還考察了色譜柱、柱溫、流動相酸度的變動對分離度等結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)在測定條件下，系統(tǒng)的輕微變動對試驗結(jié)果影響不大，系統(tǒng)耐用性良好。

藥品是特殊商品，必須符合安全、有效、可控、穩(wěn)定的要求。質(zhì)量標(biāo)準完善與否直接關(guān)系到上市藥品質(zhì)量控制水平的高低，關(guān)系到藥品的安全有效。本試驗在婦樂顆粒原質(zhì)量標(biāo)準的基礎(chǔ)上，增加了大黃素、大黃酚含量指標(biāo)的控制，對于進一步完善質(zhì)量標(biāo)準、加強質(zhì)量控制具有積極意義。

[1]丁 艷，黃志華.大黃素藥理作用研究進展[J].中藥藥理與臨床，2007，23（5）：236-238.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：384，17.

[3]張文婷，王嘉仡，陳紀良.含大黃蒽醌制劑中大黃酚的測定[J].中成藥，2003，25（1）：72.