貼膏劑微生物限度檢查法研究

任安民，由亞寧，王小亮，繩金房

（1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061； 2.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061）

貼膏劑包括橡膠膏劑、巴布膏劑（凝膠膏劑）和貼劑，是由藥材提取物、藥材或/和化學藥物與適宜的基質(zhì)和基材制成的，供皮膚貼敷，可產(chǎn)生局部或全身性作用的一類片狀外用制劑。2005年版《中國藥典》收載貼膏劑7種、貼劑2種。BP2007版、EP6.0版、USP30版及美國、歐洲和日本三方協(xié)調(diào)一致的藥品微生物限度檢測方法中，均對透皮貼劑規(guī)定了檢測方法和限度標準。BP2007版規(guī)定每貼不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和腸桿菌科與其他革蘭陰性菌，需氧菌（細菌與真菌）不得過5×102CFU；USP30版規(guī)定每貼不得檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，細菌數(shù)不得過2×102CFU，霉菌和酵母菌數(shù)不得過20 CFU（國外貼劑與中國貼劑規(guī)格、大小略有不同）。2005年版《中國藥典（二部）》[1]微生物限度檢查法引入驗證理念，使得檢測結(jié)果更科學準確。實際工作中，貼膏劑微生物限度標準中供試品溶液的制備方法不十分明確，不利于貼膏劑質(zhì)量控制。筆者參考文獻[2-3]對兩種市售貼膏劑微生物限度檢查方法進行了方法學驗證，報道如下。

1 試驗材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylocous aureus）[CMCC（B）26 003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subilis）[CMCC（B）63501]，大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，黑 曲 霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。

稀釋液：pH=7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

沖洗液：0.1%蛋白胨水溶液。

培養(yǎng)基：胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基（批號為080121），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號為080215），pH=7.0氯化鈉-蛋白胨（批號為080626），均由北京第三制藥廠生產(chǎn)；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號為080324，北京陸橋技術(shù)有限責任公司）。

供試品：傷濕止痛貼膏（西安強生藥業(yè)有限公司，規(guī)格為7 cm×10 cm，批號為20080231）；正傷消痛膏（西安千禾制藥有限公司，規(guī)格為7.6 cm×11 cm，批號為20080503）。

其他：無菌吸管、試管、器皿、鑷子、剪刀、集菌儀、集菌器、90 mm平皿、約為100 cm2滅菌玻璃板、振蕩器、約為80 cm2滅菌紗布等。

2 方法與結(jié)果

2.1 預試驗

2.1.1 稀釋劑選擇

配制各種稀釋劑，即A液為pH=7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液，B液為A液+3%吐溫80+十四烷酸（B1為5%，B2為10%，B3為15%，B4為 20% ），C液為 A液+6%吐溫 80+十四烷酸（C1為5%，C2為10%，C3為15%，C4為20%），D液為A液+9%吐溫80+十四烷酸（D1為5%，D2為10%，D3為15%，D4為20% ），E液為A液+12%吐溫80+十四烷酸（E1為5%，E2為10%，E3為15%，E4為20%），F(xiàn)液為A液+十四烷酸（20%）。選用各稀釋液，分別采用振蕩法（振蕩30 min）與均質(zhì)器拍擊法對貼膏劑進行供試液制備試驗，觀察其分散情況，以便選擇適合該供試品的稀釋劑。結(jié)果以A液為釋釋劑時，供試液較澄清，便于取用，但膏劑之間相互粘連（可采用在黏膠層粘貼紗布消除），適用于常規(guī)法與薄膜法檢驗；以B液為稀釋劑時，B1液部分分散，B4液分散較強，B2液與B3液分散適中，供試液因有黏性，適用于常規(guī)法，但不適用于薄膜法檢驗；以C液（與B液基本相似）為稀釋劑時，供試液比B供試液略顯黏、渾；以D液與E液（基本相似）為稀釋劑時，供試液較黏稠，不便于吸取；以F液為稀釋劑時，供試液略顯稀、渾，有明顯的油水分層，不便于檢驗操作。因此選A液作為稀釋劑，采用在黏膠層粘貼紗布以消除相互粘連。

2.1.2 供試液制備方法

進行了振蕩法（30 mm）與均質(zhì)器拍擊法（拍擊3，6，9 min）比較試驗。拍擊法操作時間較短，但其無菌操作的安全性與簡便性卻不如振蕩法，且設(shè)備成本大于振蕩法。結(jié)果拍擊3 min時，分散效果不太理想；拍擊6 min與9 min時，會不同程度出現(xiàn)橡膠黏團而影響供試液吸取。綜合考慮，選用振蕩法（30 min）。

2.1.3 取樣量選擇

取10貼（規(guī)格為7 cm×10 cm）溶于500 mL稀釋劑時根本無法振蕩，若采用容量大于500 mL的三角瓶，則使試驗難度增加且不符合實際。取5貼（規(guī)格為7 cm×10 cm）溶于500 mL稀釋劑時振蕩效果尚可，但三角瓶會在振蕩器中擺動而不安全；若取2貼溶于200 mL稀釋劑，由于各產(chǎn)品規(guī)格不同，不能按貼報告。若按100 cm2大小取貼劑，溶于100 mL稀釋劑，則適用于不同類型、規(guī)格的貼膏劑。因此采用按100 cm2大小取貼劑溶于100 mL稀釋劑的方法取樣，以10 cm2報告結(jié)果。

2.2 傷濕止痛貼膏微生物限度檢查

2.2.1 菌回收率測定

1）菌懸液制備

分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基，于35℃培養(yǎng)24 h；分別接種白色念珠菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖肉湯和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，于25℃分別培養(yǎng)3 d和7 d。將上述培養(yǎng)物均用pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制備成每1 mL所含菌數(shù)不大于100 CFU的菌懸液。

2）供試液制備

取傷濕止痛貼膏，置滅菌玻璃板上，將粘面朝上，以無菌操作揭除粘膠層，粘貼滅菌紗布，剪取大小約100 cm2的塊狀，溶于100 mL稀釋液中，振蕩30 min，作為1∶10的供試液。

3）常規(guī)法[4]

試驗組：取1∶10供試液1 mL和試驗菌50～100 CFU，采用常規(guī)法進行細菌、霉菌和酵母菌菌數(shù)測定；供試品對照組：取1∶10供試液1 mL，按試驗組方法（不加試驗菌）測定供試品的本底菌菌數(shù)；菌液組：依法測定所加的試驗菌菌數(shù)。結(jié)果見表1。可見，金黃色葡萄球菌回收率低于70%，不可采用常規(guī)法；試驗組霉菌和酵母菌的回收率均高于70%，可采用常規(guī)法。

表1 傷濕止痛貼膏常規(guī)法菌回收率測定結(jié)果（n=2）

4）薄膜過濾法

取1∶10的供試液10 mL，加入含50 mL稀釋液的薄膜過濾器中過濾，用沖洗液（100 mL/次）沖洗3次。在最后一次沖洗液中加入50～100 CFU試驗菌，取出濾膜貼于已制備的培養(yǎng)基上，平行2皿，求其平均數(shù)，測定其菌數(shù)。結(jié)果試驗組、供試品對照組、菌液組金黃色葡萄球菌的菌數(shù)分別為73，0，79個/mL，回收率為92.40%，說明可采用薄膜過濾法（沖洗液100 mL/次，沖洗3次）對樣品進行細菌菌數(shù)測定。

2.2.2 控制菌驗證

試驗組：取菌回收率測定項下供試液10 mL和金黃色葡萄球菌試驗菌液1 mL，加入到100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按金黃色葡萄球菌檢查法試驗；取菌回收率測定項下供試液10 mL和銅綠假單胞菌試驗菌液1 mL，加入到100 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，按銅綠假單胞菌檢查法試驗。

陰性對照組：取菌回收率測定項下供試液10 mL和大腸埃希菌試驗菌液1 mL，加入到100 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按金黃色葡萄球菌檢查法試驗；取菌回收率測定項下供試液10 mL和大腸埃希菌試驗菌液1 mL，加入到100 mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，按銅綠假單胞菌檢查法試驗。結(jié)果見表2。可見，試驗組未檢出試驗菌，陰性對照組未檢出陰性對照菌。

表2 傷濕止痛貼膏和正傷消痛膏控制菌驗證試驗結(jié)果

2.3 正傷消痛膏微生物限度檢查

2.3.1 菌回收率測定

常規(guī)法：菌懸液制備及測定方法同2.2.1項下方法，結(jié)果見表 3。可見，金黃色葡萄球菌回收率低于70%，不可采用常規(guī)法；試驗組霉菌和酵母菌的回收率均高于70%，可采用常規(guī)法。

表3 正傷止痛貼膏常規(guī)法菌回收率測定結(jié)果（n=2）

稀釋法：取1∶10的供試液1 mL，按0.5 mL/皿與0.2 mL/皿接種量，同時加入試驗菌50～100 CFU，采用培養(yǎng)基稀釋法進行金黃色葡萄球菌回收率測定，每組平行2份測定其菌數(shù)。結(jié)果金黃色葡萄球菌接種量為0.5 mL/皿時，試驗組、對照組、菌液組菌數(shù)分別為38，0，70個/mL，回收率為54.29%；接種量為0.2 mL/皿時，試驗組、供試品對照組、菌液組菌數(shù)分別為84，0，88個/mL，回收率為95.45%。可見，可采用稀釋法（0.2 mL/皿）對樣品進行細菌數(shù)測定。

2.3.2 控制菌驗證

驗證方法同2.2.2項下方法，結(jié)果與傷濕止痛貼膏控制菌驗證試驗結(jié)果相同（表2）。

3 討論

按2005年版《中國藥典（一部）》附錄微生物限度檢查法進行檢驗，本品可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2 mL/皿）進行細菌數(shù)檢查，采用常規(guī)法進行霉菌和酵母菌數(shù)檢查，采用常規(guī)法進行控制菌檢查。

因橡膠膏劑制備過程中常用溶劑有汽油、正己烷，材料為橡膠、松香、松香衍生物、凡士林、羊毛脂等，試驗中不易找到可使背襯層與藥物貼庫層、粘膠層分離的適宜溶劑，故選用pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，通過振蕩可使大部分藥物貼庫層中可能存在的菌體沉降入水相中。驗證試驗結(jié)果表明，各菌回收率均大于70%，方法可靠。巴布膏劑常用的材料有聚丙烯酸鈉、羧甲基纖維素鈉、明膠、甘油和微粉硅膠等親水性基質(zhì)，制備過程用pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液振蕩30 min，粘膠層迅速膨脹并有小碎片掉落，故考慮振蕩時間應(yīng)在30 min以內(nèi)。另外，巴布膏劑因系中藥熬制，若有抑菌作用，其供試液也可用稀釋法或薄膜法進行驗證。

藥典收載品種和非藥典收載品種的貼膏劑面積、規(guī)格不同，建議取樣量為100 cm2大小溶于100 mL稀釋液，結(jié)果以10 cm2為單位報告。若以每貼為單位報告，可取2貼溶于200 mL稀釋液，吸取10 mL，采用薄膜法過濾，取濾膜貼與相應(yīng)的培養(yǎng)基計數(shù)結(jié)果乘以10，即為每貼含菌量。另外，建議限度標準可規(guī)定每10 cm2中細菌數(shù)不得過100 CFU，霉菌數(shù)不得過10 CFU，不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，也可折算后按每貼報告。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：93-101.

[2]任安民，李秋菲，繩金房，等.注射劑無菌檢查的方法學驗證試驗[J].西北藥學雜志，2009，24（1）：51-52.

[3]李秋菲，唐振宏，徐長根，等.5中外用制劑微生物限度檢查法中菌落計數(shù)方法驗證[J]. 中國藥業(yè)，2008，17（22）：39.

[4]應(yīng)國紅，鄧 穎，馮豐湊，等.外用制劑微生物限度檢查方法研究[J?.中國藥業(yè)，2008，17（21）：32-33.