不同方法除鞣質后貫葉金絲桃提取物中金絲桃素的含量變化*

李前瓊 ，王金林 ，王曉利 ，張俊松 ，張德志

（1.深圳職業技術學院，廣東 深圳 518055； 2.廣東藥學院，廣東 廣州 510006）

貫葉金絲桃 Hypericum performatum L.又名貫葉連翹、圣約翰草，為藤黃科金絲桃屬植物，具有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止血、利濕止痛等功效[1]。研究證明，貫葉金絲桃主要活性成分金絲桃素（hypericin，HY）具有抗抑郁、抗病毒、抗腫瘤等作用[2-4]。在醫藥工業和臨床上目前應用的主要是貫葉金絲桃的提取物，但其中還含有鞣質、有機酸、揮發油等雜質成分，其中鞣質質量分數高達10%[5]。鞣質又稱單寧或植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內且結構復雜的多元酚化合物，可溶于水、乙醇、丙酮等，高含量的鞣質會對后續分離純化HY帶來困難。本試驗考察了不同方法除去貫葉金絲桃提取物中的鞣質，并利用高效液相色譜（HPLC）法測定除鞣質后HY含量的變化和收率。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器，LC-20AT輸液單元，CBM-20Alite系統控制器，島津LC-20A配套處理軟件LC-solution；KQ2200DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorious萬分之一電子天平。金絲桃素對照品（瑞士Alexis Biochemicals公司，純度為99.2%，批號為L15535/a）；貫葉金絲桃提取物（常州神馬植物提取有限公司）；明膠（廣東環凱生物科技有限公司）；甲醇為色譜純（天津協和昊鵬色譜科技有限公司）；乙醇為分析純（臺山市粵僑試劑塑料有限公司）；水為超純水；其余試劑為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 HY含量測定

2.1.1 色譜條件[6]

色譜柱：Phenomenex-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.006 mol/L Na2HPO4（7∶1，V/V，H3PO4調pH=6.5）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：590 nm；進樣量：10 μL。

2.1.2 溶液制備

精密稱取貫葉金絲桃提取物0.5 g，置10 mL棕色量瓶中，以色譜純甲醇超聲溶解后定容，作為供試品溶液。精密稱取金絲桃素對照品0.97 mg，置5 mL棕色量瓶中，色譜純甲醇超聲溶解后定容，精密吸取1 mL，置10 mL棕色量瓶中定容，配制成質量濃度為0.019 4 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

標準曲線繪制：精密吸取對照品溶液，分別進樣1，5，10，15，20，25 μL，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積對HY進樣量作線性回歸，回歸方程為 Y=2 722 400.781X-6 184.994，r=0.999 9（n=6）。結果表明 HY進樣量在0.019 4～0.776 0 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液，連續進樣5次，測定峰面積。結果峰面積的 RSD為0.041%（n=5），表明方法精密度良好。

重現性試驗：分別精密稱取同一批次樣品0.5 g，依法制備供試品溶液并測定。結果HY的平均含量為0.088%，RSD為0.067%（n=6），表明方法重現性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，于 0，2.5，5.0，7.5，10 h 時依法測定。結果的 RSD為0.16%（n=5），表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：精密吸取供試品溶液5份，各500 μL，分別精密加入0.019 4 mg/mL的對照品溶液500 μL，混勻后依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 HY加樣回收試驗結果 （n=5）

2.2 未除鞣質提取液制備

精密稱取貫葉金絲桃提取物2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超聲處理40 min，取出冷卻至室溫，過濾，濾液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm濾膜過濾，以HPLC法測定HY含量，計算出貫葉金絲桃提取物中HY含量。

2.3 不同方法除鞣質提取液制備

明膠沉淀法：精密稱取貫葉金絲桃提取物2 g，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20 mL，密塞后超聲處理40 min，取出冷卻至室溫。加入10%明膠溶液5 mL（慢加快搖），靜置片刻后濾去沉淀，調乙醇質量分數至75%以除去過量明膠，過濾，濾液定容于50 mL量瓶中，0.45 μm 濾膜過濾，HPLC法測除鞣質提取液中HY含量。減壓揮去溶劑后，測定除鞣質后貫葉金絲桃提取物固形物質量，計算HY的含量和收率。

改良明膠沉淀法：加入10%明膠溶液5 mL（慢加快搖）前的操作同明膠沉淀法，靜置片刻，調乙醇質量分數至75%，4℃冷藏過夜，過濾，濾液定容于50 mL量瓶中，后續操作同明膠沉淀法。

堿性醇沉法：密塞后超聲處理40 min前的操作同明膠沉淀法，取出冷卻至室溫，調乙醇質量分數至80%后，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節至pH=8，4℃冷藏過夜，過濾，濾液定容于50 mL容量瓶中，后續操作同明膠沉淀法。

2.4 除鞣效果檢測

分別取2.3項下各除鞣液1 mL，滴加10%明膠溶液1 mL，根據藥液渾濁程度檢驗除鞣效果。結果明膠沉淀法和改良明膠沉淀法能完全去除鞣質，在除鞣提取液中滴加明膠溶液未出現混濁，溶液澄明；而堿性醇沉法除鞣液加明膠溶液后則出現少許混濁，說明除鞣不完全。

2.5 樣品含量和收率測定

分別取貫葉金絲桃提取物除鞣前后的樣品液，在2.1.1項下色譜條件下測定，以外標法計算HY含量和收率，結果見表2。可見明膠沉淀法除鞣質后提取物固形物質量降低較多，雖除鞣完全，但除鞣后HY損失較大，收率較低；堿性醇沉法除鞣質，HY收率雖較高，但除鞣不完全；改良明膠沉淀法除鞣質HY損失較少，純度有所提高，且鞣質去除完全，可以有效減少后續分離純化色譜填料對鞣質的死吸附，有利于填料再生，減少廢料產生和環境污染。

表2 3種方法HY含量變化和收率比較（n=3）

3 討論

獲得高純度的HY是當前世界植物藥市場的研究熱點之一，但貫葉金絲桃中大量存在的鞣質，為后續分離純化帶來困難。不同方法除鞣質后對貫葉金絲桃提取物中活性成分HY含量和收率的影響尚未見報道。本試驗建立了改良明膠沉淀除鞣法，其HY含量和收率較高，且簡便易行、重現性好，可供植物活性成分純化工藝的研究和改進參考。

[1]李 艷，曹學麗，付 鵬，等.貫葉金絲桃活性成分及其分離純化與檢測方法的研究進展[J].藥學進展，2008，32（1）：15.

[2]胡 然，庫寶善，張永鶴.人類免疫缺陷病毒與皰疹病毒感染具有相關性[J]. 生理科學進展，2004，35（1）：63-65.

[3]楊得坡，甘良春，胡海燕.國外對貫葉連翹抗抑郁療效的臨床驗證[J].中西醫結合學報，2004，2（3）：231-238.

[4]施正福，范 焱.貫葉金絲桃的藥理作用研究進展[J].中國現代應用藥學雜志，2000，17（3）：190-193.

[5]李 瑩，禹玉洪，楊書良，等.貫葉連翹的提取與除鞣工藝研究[J].哈爾濱商業大學學報，2006，22（2）：13.

[6]張俊松，王曉利，羅 謙，等.不同產地貫葉金絲桃中金絲桃素和偽金絲桃素的含量分析[J].中國藥業，2006，15（12）：11.