葡萄糖氧化酶法篩選西洋參干預胰島素抵抗脂肪細胞模型的活性成分

葛鵬玲，李冀，馬育軒，尚廣巍

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

胰島素抵抗(IR)是由遺傳和環境因素導致的機體對胰島素生理作用的反應性降低。即胰島素促進葡萄糖攝取作用受損，導致代償性胰島素分泌增多，其重要標志為高胰島素血癥［1］。主要表現為外周組織對胰島素敏感性下降，對葡萄糖的利用障礙［2］。

本實驗通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細胞模型葡萄糖消耗量的影響，篩選西洋參干預胰島素抵抗的有效成分。從而為進一步探討其作用機制及開發新藥奠定基礎。

1 材料及方法

1.1 細胞株

小鼠3T3－L1前脂肪細胞株來源于American Type Culture Collection(ATCC)，由中國醫學科學院協和醫科大學細胞中心提供。

1.2 儀器與試劑

胰島素(諾和諾德公司);地塞米松(Sigma公司);異丁基—甲基—黃嘌呤(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA，澳大利亞ST1006);DMEM培養液(Gibco公司);葡萄糖氧化酶法測定試劑盒(上海伊華生物科技有限公司);熒光顯微鏡(OLYMPUS IX71);CO2培養箱(Forma Scientific);超凈工作臺(上海造鑫企業有限公司);酶標儀(TECAN公司)。

1.3 西洋參單體成分的分離

將西洋參的根部用70%EtOH回流提取，將此提取物進行AB－8型大孔樹脂柱色譜分析，按不同濃度洗脫，得到西洋參95%醇提組、西洋參60%醇提組、西洋參30%醇提組和水提組四個部分。前期藥效學試驗證明，西洋參60%醇提組為活性部位。再將西洋參60%醇提部位用硅膠柱色譜及HPLC等分離技術與方法分離和純化，通過理化常數及光譜數據確定其結構。共得12個化合物。

1.4 3T3－L1前脂肪細胞培養及誘導分化

培養:3T3－L1前脂肪細胞可經定向誘導分化為成熟的脂肪細胞。3T3－L1脂肪細胞培養包括培養、傳代、凍存、復蘇及誘導分化過程。將3T3－L1前脂肪細胞種入25cm2細胞培養瓶，加入含10%優級小牛血清及青、鏈霉素的高糖(25mmol·L－1glucose)DMDM培養液4～5mL，置37℃細胞孵育箱中，5%CO2條件下培養，每2d換1次培養液。每天觀察細胞生長情況，細胞生長至80%滿后進行傳代或凍存。

分化:3T3－L1前脂肪細胞生長至接觸抑制，待細胞匯合2天后加0.05mmol·L－13－異丁基－1－甲基黃嘌呤(IBMX)，1mmol·L－1地塞米松，10mg·L－1胰島素和10%小牛血清的高糖培養基培養48h，10mg·L－1胰島素和10%小牛血清的高糖培養基培養48h，10%小牛血清的高糖培養基培養，2d換1次培養液，8～12d細胞90%以上呈成熟脂肪細胞表形。

1.5 葡萄糖氧化酶法測培養基中葡萄糖濃度

1瓶葡萄糖工作試劑加100mL ddH2O，振蕩混勻;96孔板中每孔取8μL培養液，加入含1mL工作試劑的試管中，振蕩混勻，另取標準液8μL，加入含1mL工作試劑的試管中;37℃水浴20min;每試管取100μL混合液，加入96孔酶標板中;酶標儀在510nm處測吸光光度值(OD值);根據公式計算待測液葡萄糖濃度。待測葡萄糖濃度(mmol·L－1)=待測液OD值/標準液 OD 值 ×5.5mmol·L－1。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 成熟脂肪細胞誘導

光鏡下3T3－L1前脂肪細胞形態與成纖維細胞相似，呈長梭型，細胞內沒有脂肪積聚，誘導分化后，細胞形態變圓，胞漿出現脂滴，隨著分化程度的加深，脂滴積聚增多。誘導分化8d后，90%以上呈成熟脂肪細胞表形，胞漿內有大量的脂滴，如圖1所示。

圖1 脂肪細胞

2.2 胰島素抵抗脂肪細胞模型的建立及鑒定

將24孔培養板中分化成熟的脂肪細胞，以含1%BSA的低糖DMEM培養基培養12h后，分為正常葡萄糖正常胰島素組(5.5mmol·L－1葡萄糖，1×10－9mol·L－1胰島素)及高葡萄糖高胰島素組(25mmol·L－1葡萄糖，1 ×10－6mol·L－1胰島素)，每組7個樣本。干預24h后，通過葡萄糖消耗試驗測定兩組脂肪細胞葡萄糖消耗量的情況。

表1 高糖高胰島素對葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

表1 高糖高胰島素對葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

注:與正常組比較，★P<0.01;RG－葡萄糖剩余量，CG－葡萄糖消耗量。

2.70±0.15 2.80±0.15高糖高胰島素組 4.21±0.22★ 1.29±0.22正常組★

如表1所示，與正常葡萄糖正常胰島素組葡萄糖消耗量比較，高葡萄糖高胰島素組葡萄糖消耗量明顯下降，差異極顯著(P<0.01)，說明應用此法可建立胰島素抵抗細胞模型。

2.3 西洋參單體成分對胰島素抵抗脂肪細胞模型葡萄糖消耗量的影響

實驗分為空白對照組、模型組、西洋參單體成分組(12)及羅格列酮組。干預培養24h后，通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細胞模型葡萄糖消耗量的影響，篩選西洋參干預胰島素抵抗的活性成分。

表2 藥物對IR細胞模型葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

表2 藥物對IR細胞模型葡萄糖消耗量的影響(±s，n=7)

注:與模型組比較，☆P<0.05，★P<0.01。

2.72±0.17 2.78±0.17模型組 4.10±0.22 1.40±0.22羅格列酮組 3.24±0.25★ 2.26±0.25★人參皂苷R3組 3.25±0.10★ 2.25±0.10★20(R)人參皂苷Rb1組 3.56±0.12★ 1.94±0.12★20(R)人參皂苷Rb2組 3.61±0.15★ 1.89±0.15★擬人氏皂苷F11組 1.36±0.11☆ 1.73±0.11空白組☆

實驗結果如表2所示，與模型組細胞葡萄糖消耗量比較，羅格列酮組、人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、擬人參皂苷F11組細胞葡萄糖消耗量有不同程度的升高，其中人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、羅格列酮組葡萄糖消耗量明顯升高，差異極顯著(P<0.01)，擬人參皂苷F11組差異顯著(P<0.05)。其余化合物組與模型組比較，葡萄糖消耗量無統計學差異。提示，20(R)人參皂苷 Rb1，20(R)人參皂苷 Rb2，人參皂苷R3，擬人參皂苷F11可能為西洋參干預胰島素抵抗脂肪細胞模型的活性成分。

3 討論

細胞模型相對于動物模型具有重復性好、造模周期短、外界影響因素易于控制的優點。建立胰島素抵抗的細胞模型，不僅廣泛應用細胞水平研究胰島素抵抗的發病機制，尤其適用于改善胰島素抵抗藥物的篩選及其機制研究。

1988年，Reaven［3］提出的胰島素抵抗定義為胰島素靶細胞對胰島素介導的葡萄糖攝取及利用的抵抗，它反映的是胰島素的糖代謝效應。在細胞實驗中，對胰島素敏感性的評價主要采用胰島素刺激下對同位素標記的脫氧葡萄糖的攝取。但此法成本高、毒害作用大。葡萄糖氧化酶法測定脂肪細胞培養基中的葡萄糖消耗量，相對污染小、經濟方便、優越性明顯，可作為評價胰島素敏感性的良好手段。

本實驗通過葡萄糖消耗試驗測定西洋參單體成分對IR脂肪細胞模型葡萄糖消耗量的影響，與模型組細胞葡萄糖消耗量比較，羅格列酮組、人參皂苷R3組、20(R)人參皂苷Rb1組、20(R)人參皂苷Rb2組、擬人參皂苷F11組細胞葡萄糖消耗量有不同程度的升高，20(R)人參皂苷 Rb1，20(R)人參皂苷 Rb2，人參皂苷R3，擬人參皂苷F11可能是西洋參干預胰島素抵抗脂肪細胞模型的活性成分。

［1］李冀，馬育軒，高彥宇，等.中醫藥對2型糖尿病胰島素抵抗的研究進展［J］.中醫藥信息，2009，26(3):5－7.

［2］李冀，馬育軒，葛鵬玲，等.西洋參治療胰島素抵抗大鼠活性部位對骨骼肌轉運蛋白－4mRNA表達的影響［J］.中醫藥學報，2009，37(5):9－11.

［3］Reaven GM.Role of insulin resistance in human diseases［J］.Diabetes，1988，37(12):1595－1607.