丙型肝炎病毒抗體雙抗原夾心法的應用探討

王穎瑛

HCV是輸血后肝炎的重要病因，主要通過血液或血液制品傳播，HCV感染呈世界性分布，我國感染者約有4000萬，為控制HCV經血液傳播，要求對獻血者進行抗-HCV的檢測。常用的抗-HCV檢測試劑均采用間接酶聯免疫法，該方法中包被抗原的組成和質量是關鍵因素。近年來對抗-HCV間接酶聯免疫法試劑單獨檢測陽性，且在臨界值附近的樣本，用雙抗原夾心酶聯免疫法試劑檢測均為陰性，我們建立了雙抗原夾心ELISA方法［1］。改進HCV的血清學診斷，取得良好的效果，現匯報如下。

1 材料和方法

1.1 血清標本 包括血液篩查陰性標本420份，質控標本430份。

1.2 抗原的制備 嵌合表位抗原包括HCV-NS3-C-NS4-NS5，以包涵體形式表達，通過SP-SepharoseFF或Q-Sepharose FF離子交換層析進行純化，將所收集的洗脫峰再用Sephadex G-50柱凝膠過濾，SDS-PAGE鑒定抗原蛋白。

1.3 試劑 吉比愛及Ortho丙肝病毒抗體酶聯免疫診斷試劑檢測。ChironRIBA確認試劑。

1.4 雙抗原夾心法 用50mmol/L pH916碳酸鹽緩沖液(包被液)稀釋抗原至工作濃度。多肽抗原工作濃度為:結構區多肽 15 Lg/ml，N S4 區多 0.5Lg/ml，N S5 區多肽 0.25 Lg/ml。基因工程表達抗原工作濃度C7和C11均為1 μg/ml。每孔加100 μl，置37℃保溫1 h后于4℃過夜。用含30%小牛血清PBST封閉，每孔加200 μl，置37℃保溫1 h。倒掉封閉液，每孔加50 μl樣品稀釋液，5 μl樣品，置37℃30 min。用PBST洗板5次。用棋盤滴定法選擇最適酶稀釋度，用稀釋液將酶標記抗原稀釋至工作濃度。每孔加50 μl，置37℃保溫15 min。PBST洗板5次。每孔加底物緩沖液50 μl，顯色劑(TMB)50Ll，置37℃顯色10 min。每孔加2 mol/LH2SO 450 μl終止反應，在Labsystem sM ult iskanM S型酶標儀于450 nm測吸光度A值，標本450 nm的A值大于或等于臨界值(Cutoff value)者為陽性，反之為陰性。

2 結果

對240份HCV抗體陽性標本進行檢測，雙抗原夾心法檢測有3份標本未檢出。3份樣本經ChironRIBA確認試劑檢測，結果為陽性。敏感性較高99.85%，見表1。

表1 240份HCV抗體陽性標本檢測結果

3 討論

HCV是輸血后肝炎的重要病因，主要通過血液或血液制品傳播，HCV感染呈世界性分布，我國感染者約有4000萬，為控制HCV經血液傳播，要求對獻血者進行抗-HCV的檢測。酶聯免疫吸附測定(EL ISA)檢測抗-HCV抗體是丙型肝炎病毒(HCV)感染診斷的主要方法。目前的抗-HCV酶聯免疫診斷試劑均采用二抗作酶結合物［2-3］，由于血清中IgG含量高，故少量的非特異吸附即可造成假陽性結果，血清中類風濕因子等也可能干擾檢測結果，且實驗操作較繁瑣，檢測時間較長。檢測HCVRNA的PCR法雖可進行早期診斷，但費時、費力，且試劑昂貴，均較難普及。由于雙抗原夾心法不需要稀釋血清產品，不受類風濕因子等的干擾，具有較高的特異性;可以同時檢出血清中各類抗體，特別是IgM類抗體，因此可以縮短從病毒感染到用ELISA法檢出抗體之間的“窗口期”。建立雙抗原夾心ELISA對于提高HCV感染診斷試劑的特異性和檢出率，縮短檢測時間，均有重要意義［4］。陽性標本的結果均為陰性，表明該試劑檢測丙型肝炎病毒抗體試劑具有很好的特異性。HCV抗體陽性的240份標本有3份未檢出，這3份樣本使用國產吉比愛和Ortho間接丙肝病毒抗體酶聯免疫診斷試劑的檢測結果也均為陰性，經Chiron RIBA確認試劑檢測后，結果為陽性，分析其原因可能為酶聯試劑所采用的HCV抗原為嵌合表達的抗原，而Chiron RIBA確認試劑是將HCV抗原分別表達并固定于膜上，檢測針對4個抗原的HCV抗體，結果判斷與酶聯法不同，另外酶聯試劑與RIBA確認試劑所用抗原也有一定的差異。雙抗原夾心丙型肝炎病毒抗體酶聯免疫診斷試劑對所檢測的質控標本的檢測總符合率達99.85%，且敏感性和特異性均較好，有望用于臨床血液標本的篩查。

［1］ColinC，LanoirD，TouzetS，et al.Sensitivityandspecificityofthird-generationhepatitisCvirusantibodydetectionassay:ananalysisoftheliterature.JournalofHepatitis，2001，8(1):87-95.

［2］宋曉國.重組丙型肝炎病毒抗原的研究.軍事醫學科學院院刊，2001，25(2):91.

［3］謝立.丙型肝炎病毒檢測方法的研究進展及其臨床意義.世界華人消化雜志，2005，13(7):884-886.

［4］王國華.雙抗原夾心與間接ELISA法檢測抗HCV對比研究.中國醫學檢驗雜志，2005，6(4):318-319.