溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系分配行為的研究

近年來，由于雙水相萃取技術在微生物、有機化合物等的分離和純化、預濃集過程中表現出相當好的性能，并有望用于大規模提取和純化生物活性物質，因此越來越受到人們的關注和重視[1～5]。我國粵西地區盛產的中草藥溪黃草，性味苦涼,具有清肝熱、利濕毒、明雙目、健脾活血和抗癌等功效，臨床可用于治療肝膽濕熱、脾失健運所致的脅脹疼痛、食欲不振等癥,對眼赤目痛、腸胃消化不良亦有較好療效。溪黃草主要含有黃酮類化合物、二萜化合物等[6,7]。

作者在此研究了溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系的分配行為，探討了聚乙二醇和磷酸鈉的用量、溫度、溪黃草黃酮濃度等對雙水相及萃取率的影響，為黃酮類化合物的提純和富集提供了一些有意義的信息。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

溪黃草，購于茂名市醫藥公司。

聚乙二醇4000、磷酸鈉、結晶氯化鋁、 無水乙酸鈉、 乙醇(95%)等，均為分析純。

WFZ-26A型紫外分光光度計，天津市光學儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 溪黃草黃酮提取液的制備[8]

稱取一定量干燥的溪黃草粉末,在索氏抽提器中用石油醚脫脂至無色,冷卻后蒸出石油醚,加入一定量的75%乙醇抽提至無色，即得溪黃草黃酮提取液。將提取液全部移至100 mL容量瓶，備用。

1.2.2 樣品溶液的制備

取溪黃草黃酮提取液5 mL于50 mL容量瓶中，加入5 mL 0.1 mol·L-1AlCl3溶液和7.5 mL 1 mol·L-1NaAc溶液，用75%乙醇稀釋至刻度，即得樣品溶液。

1.2.3 雙水相的配制

稱取一定量的磷酸鈉于比色管中，加入15 mL 0.05 mol·L-1PEG4000水溶液，在一定的溫度下溶解靜置，形成雙水相。

1.2.4 分配行為的研究

用移液管移取3 mL樣品溶液加入到聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系中，攪拌均勻，靜置分層，待分配達平衡后，分別吸取上下相溶液,用紫外分光光度計測定其在420 nm的吸光度[9]。根據吸光度的比值,按下式計算溪黃草黃酮在雙水相體系中的分配系數(K)和溪黃草黃酮的萃取率(Y)。

R=VU/VL

K=cU/cL

Y=cUVU/(cUVU+cLVL)

式中：R為相體積比；VU、VL分別為上下相體積；cU、cL分別為溪黃草黃酮在上下相的濃度。

2 結果與討論

2.1 質量配比(mPEG/mNa3PO4)對雙水相萃取溪黃草黃酮的影響(表1)

表1 質量配比(mPEG/mNa3PO4)對溪黃草黃酮萃取的影響

由表1可以看出：

(1)在一定溫度下，溪黃草黃酮的分配系數K均大于1。這是因為溪黃草黃酮是具有α-或β-苯基苯稠吡喃酮的強疏水性物質，由于“相似相溶原理”，它較多地分配在富含PEG4000的強疏水性上相中[10],因此其K大于1。

(2)隨著磷酸鈉相對含量的增加(即mPEG/mNa3PO4的減小)，相體積比R逐漸下降，這和文獻[10]、[11]結論一致。這是因為強電解質磷酸鈉在水中離解為正負離子之后，由于有較強的形成水合離子的能力，從而部分奪取因“范德華引力”受聚乙二醇的醚鍵氧束縛的水分子之故。

(3)在一定溫度下，溪黃草黃酮的分配系數K基本上隨著磷酸鈉相對含量的增加而上升。這與文獻[12]結論一致。這是由于磷酸鈉的鹽析作用部分奪取聚乙二醇的醚鍵氧的“束縛水”之后，使得聚乙二醇分子排列更為整齊和緊密，熵值減少，疏水性更強，更有利于溪黃草黃酮分配之故。70℃時的某些反常情況，可能與接近雙水相分相“渾濁點”80℃有關[12]。

(4) 溪黃草黃酮萃取率Y隨著磷酸鈉相對含量的減少(即mPEG/mNa3PO4的增加)而上升，這是相體積比R逐漸增大和溪黃草黃酮分配系數K逐漸減小的綜合效應，由此可見，R增大的效應占優。

2.2 溫度對雙水相萃取溪黃草黃酮的影響(表2)

表2 溫度對溪黃草黃酮萃取的影響

由表2可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和溪黃草黃酮濃度下，相體積比R隨著溫度的升高而下降。這主要是因為溫度升高時,PEG在水中的溶解度增加， PEG分子部分轉移到富含水的下相，導致上相體積減小、下相體積增大。

(2)溪黃草黃酮的分配系數K在mPEG/mNa3PO4≤1.50時，隨溫度的升高而下降；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50時，卻隨溫度的升高而上升。這是因為溫度升高時，體系粘度減小，擴散系數增大，由濃度差所推動的“擴散作用”增強，溪黃草黃酮在上下相的濃度趨于相等，導致K降低而趨于1；另一方面，溫度升高，分子的熱運動加劇，溪黃草黃酮脫離親水性強的下相而進入疏水性強的上相概率增加，同時PEG醚鍵氧束縛水的能力下降，疏水作用更強，導致溪黃草黃酮在上相的濃度增加，K升高。質量配比不同時的分配系數變化規律是兩方面作用綜合的結果。

(3)在mPEG/mNa3PO4≤1.50時，萃取率Y隨溫度的升高顯著降低，這是相體積比R和分配系數K都下降的加合效應的結果；而在mPEG/mNa3PO4≥2.50時，溫度升高萃取率Y變化很小，這是相體積比R下降和分配系數K上升的相消效應的結果。

2.3 溪黃草黃酮濃度對溪黃草黃酮萃取的影響(表3)

表3 溪黃草黃酮濃度對溪黃草黃酮萃取的影響

由表3可以看出：

(1)在相同mPEG/mNa3PO4和溫度下，隨著溪黃草黃酮濃度的升高，相體積比R逐漸下降。這是由于溪黃草黃酮是強疏水性的物質，有較強的吸附、加溶或排布在非離子型表面活性劑PEG周圍區域的趨勢，以促進Gibbs自由能降低、體系穩定。溪黃草黃酮的加入，必然會改變或破壞上相PEG的較為有序的狀態，使上相物質相互之間的疏水作用、加溶作用、靜電作用等發生了改變,部分PEG轉入下相,從而導致上相體積減小、下相體積增大[2]。

(2)在相同mPEG/mNa3PO4和溫度下，分配系數K基本是一個常量，差別最大是在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=70℃時，其△K/K= 7.3%。這一結果符合Bronsted所提出的統計勢力學公式[13]。

(3)在mPEG/mNa3PO4較大、溫度較高的條件下，溪黃草黃酮萃取率較高，如在mPEG/mNa3PO4為 3.00、溫度為60℃時，平均萃取率為76.69%。

3 結論

利用分光光度法研究了溪黃草黃酮在聚乙二醇/磷酸鈉雙水相體系的分配行為。結果表明，在一定的溫度和溪黃草黃酮濃度下，隨著mPEG/mNa3PO4的增大，萃取率上升；在一定的質量配比和濃度下，當mPEG/mNa3PO4≤1.50時，萃取率隨溫度的升高顯著降低；當mPEG/mNa3PO4≥2.50時，萃取率基本保持不變；在一定的質量配比和溫度下，溪黃草黃酮濃度對分配系數K(cU/cL)和萃取率基本沒有影響。在mPEG/mNa3PO4=3.00、T=60℃時，平均萃取率可達76.69%。

參考文獻：

[2] 鞏育軍，薛元英，李東升，等. 絲裂霉素在表面活性劑雙水相中的分配規律[J].應用化學，2000，17(6):657-659.

[3] 周紅航，王維香. 聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶[J].化工進展, 2009,28(2):305-308.

[4] Chethana S, Nayak C A, Raghavarao K S M S. Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains[J].Journal of Food Engineering,2007,81(4):679-687.

[5] Babu B R, Rastogi N K, Raghavarao K S M S. Liquid-liquid extraction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous two-phase system[J]. Chemical Engineering and Processing, 2008,47(1): 83-89.

[6] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：化學工業出版社，1985:826.

[7] 居學海,翟宇峰,翟錦庫，等.溪黃草中三種活性組分的電子結構與抗癌活性[J].鄭州大學學報(自然科學版),1997, 29(3):80-86.

[8] 黎或，吳志誼, 吳川,等. 可見光及紫外光分光光度法測定溪黃草總黃酮[J]. 精細石油化工,2006,23(1): 51-53.

[9] 程昆木,王斌,曾偉芹，等. 刺五加總黃酮含量的分析[J]. 人參研究,2006,18(2): 17-19.

[10] 趙曉莉,岳紅,張穎,等. 柿葉黃酮在雙水相體系中的分配行為[J].林產化學與工業,2006,26(1):83-86.

[11] 張春秀,胡小玲,盧錦花,等. 雙水相萃取法富集分離銀杏葉浸取液的探討[J]. 化學研究與應用,2001,13(6):686-688.

[12] 杜振寧，胡卓逸. 聚乙二醇雙水相體系在分離純化蛋白質中的應用[J].中國醫藥工業雜志,1990,21(10):468-471.

[13] Albertsson P A. Partition of Cell Particles and Macromolecules [M]. New York: Wiley Interscienece Division, 1971: 14-15.