一株產脂肽類生物表面活性劑菌株的分離及代謝產物分析

生物表面活性劑是微生物代謝產生的一種具有表面活性的兩性分子，分為糖脂、脂肽、脂蛋白、磷脂以及多聚糖脂等不同種類[1]。從油藏環境中篩選培養可以產生物表面活性劑的微生物(主要是假單胞菌和芽孢桿菌)[2]，其代謝產生的生物表面活性劑主要為糖脂和脂肽兩大類。

脂肽分子是由親水的肽鏈(7～10個氨基酸組成的肽鏈)和親油的脂肪酸鏈(β-羥基脂肪酸鏈或β-胺基脂肪酸鏈)兩部分組成的, 其中脂肪酸鏈上的羥基或胺基與肽鏈氨基酸上的羧基結合形成內酯鍵或酰胺鍵,使肽鏈閉合形成環狀脂肽[3]。由于其特殊的結構，脂肽表現出多種生理特性[4,5]：幫助微生物細胞粘附于烴類物質表面進行解烴代謝; 降低表面張力,促進微生物吸收和代謝疏水性物質, 以利于微生物在水不溶性物質中生存；與化學表面活性劑相比，更易于降解；在極端條件下仍能保持其活性[6～8]。因此，脂肽被廣泛地應用到石油開采等工業領域中。

作者在此采用多次富集馴化、血平板篩選方法從新疆克拉瑪依油田的油水樣中分離出3株產生物表面活性劑的菌株。對其中的L1菌株進行研究，通過分子生物學鑒定該菌與土壤芽孢桿菌同源關系最近。為脂肽類生物表面活性劑的進一步研究奠定了基礎。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

油水樣取自新疆克拉瑪依油田，密封，備用。

TLC 展開劑為氯仿∶甲醇∶水=65∶15∶2(體積比),顯色劑為0.2%茚三酮水溶液,HSGF 254 硅膠板。甲醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸、茚三酮等均為分析純。

UV-2102C型紫外可見分光光度計，SIGMA Laborzentrifugan 3K15型離心機，K12/ M14型表面張力測定儀，NICOLET 750型顯微紅外光譜儀。

1.2 培養基

(1)產表面活性劑菌富集培養基:液體石蠟1 g·L-1,MgSO40.2 g·L-1,CaCl20.02 g·L-1,KH2PO41 g·L-1,K2HPO41 g·L-1,FeCl30.05 g·L-1,NH4NO31 g·L-1,酵母膏1 g·L-1，蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

(2)血瓊脂培養基:購自北京綠源旺業科技有限公司。

(3)發酵培養基:葡萄糖25 g·L-1，KH2PO41 g·L-1,K2HPO41 g·L-1, CaCl20.04 g·L-1,NaCl 20 g·L-1, MgSO40.2 g·L-1,Na2HPO46 g·L-1,蛋白胨7.5 g·L-1,酵母膏 0.8 g·L-1,蒸餾水定容至1 L，pH值7.0～7.2。

(4)斜面培養基:牛肉膏5 g·L-1,蛋白胨10 g·L-1， NaCl 5 g·L-1，瓊脂 10 g·L-1，蒸餾水定容至1 L，pH值7.0。

1.3 分離方法

1.3.1 菌種的富集與分離

油水樣以2%(體積分數)的比例接種到產表面活性劑菌富集培養基中，25℃、165 r·min-1恒溫培養3 d。吸取4 mL培養液接種到200 mL已滅菌的新鮮富集培養液中，如此連續轉接10次。將富集培養液適當稀釋后，取0.1 mL均勻涂布于血平板上，25℃培養24 h，根據溶血環進行初步篩選。挑產溶血環的單菌落于牛肉膏平板上劃線分離4次，直至得到單菌落。顯微鏡觀察細菌的形態一致。保存于牛肉膏斜面。

1.3.2 搖瓶培養

分離的菌株接種于發酵培養基中, 170 r·min-1、25℃培養 96 h。

1.3.3 生物表面活性劑的提取[9]

取一定量發酵液,用NaOH 溶液將pH 值調至7.5～9.0，10 000 r·min-1離心15 min； 取上清液，用鹽酸調pH 值至2.0，離心收集沉淀，用等體積的CHCl3/CH3OH(體積比3∶1) 連續萃取3次；合并萃取相,濃縮,用pH值2.0 的鹽酸水溶液洗滌5 次,減壓蒸發除去有機相,用NaOH 溶液將沉淀物的pH 值調至7.0，真空干燥;加入正己烷洗滌3 次除去脂肪酸等,離心收集沉淀物并干燥,最后用CH2Cl2于50℃抽提10 h，除去CH2Cl2，即得生物表面活性劑。

1.4 分析與鑒定

1.4.1 生物表面活性劑的定性分析

采用薄層層析分析法。取提取的生物表面活性劑粗品溶于二氯甲烷中，將樣品點在硅膠板上，展開，用茚三酮原位水解顯色[10]檢測。

1.4.2 乳化指數的測定[11]

發酵液以10 000 r·min-1離心30 min，取上清液 4 mL,加入 6 mL煤油充分振蕩 2 min,靜置 24 h。觀察乳化層高度及穩定性,按下式計算 24 h乳化指數(E24)。

1.4.3 表面張力的測定

發酵液以8000 r·min-1離心20 min,取上清液測定其表面張力，對照樣為沒有加入菌種的新鮮培養基。

1.4.4 菌株鑒定

將分離純化后的菌株接種于LB培養基中，25℃、150 r·min-1培養16～20 h，離心收集細胞后用基因組DNA提取試劑盒[Tiangen Biotech (Beijing) Co.,Ltd.]提取純菌DNA。通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTACGACT-3′)用于基因組16S rDNA全長擴增，DNA凝膠回收試劑盒[Tiangen Biotech (Beijing) Co.,Ltd.]純化16S rDNA全長擴增產物。pGEM-T Easy vector system(Promega)將16S rDNA全長擴增片段與載體連接，連接產物通過CaCl2法轉化到Trans5αchemically competent cell感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)，挑取10個白斑單克隆用于ARDAR分析。牙簽挑取少量的菌體作為模板DNA，通用引物T7(5′-GGCCGCGGGAATTCGATT-3′)和Sp6( 5′-GCGAATTCACTAGTGATT-3′)用于陽性克隆驗證。陽性克隆PCR產物分別用HinfI 和HhaI進行酶切，酶切產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分析。挑取2個分型相同的陽性克隆進行測序(SinoGenoMax Co., Ltd., Beijing)，應用DNAMAN(Version 5.2.2.0)軟件對原序列進行編輯，非嵌合體序列在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數據庫中進行比對分析，尋找親緣關系最近的細菌或克隆。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

對油水樣進行富集培養，稀釋10 000倍后，取0.1 mL涂布于血平板上，利用產生物表面活性劑菌可以產生溶血圈的特性，劃線分離得到3株菌，其中溶血圈最大的一株命名為L1。

2.2 16S rDNA序列分析結果

菌株L1 16S rDNA(約1500 bp)序列與GenBank中核酸數據庫進行同源性比較結果為：該菌株與已培養的土壤芽孢桿菌(Brevibacillusagri)同源性最近，達到了99%。與該菌同源性超過98%的已知菌系統發育分析結果見圖1。

圖1 依據16S rDNA基因序列構建的菌株L1和相關屬菌種的系統發育樹

2.3 生物表面活性劑乳化性能

圖2是生物表面活性劑對煤油的乳化指數隨時間變化的關系。從圖2可以看出，在72 h后，乳化指數仍達到64%，說明該生物表面活性劑對煤油乳化穩定性良好。

圖2 生物表面活性劑的乳化性能

2.4 生物表面活性劑的定性分析

發酵液預處理后，用鹽酸調pH值至2，4℃靜置過夜，產生沉淀，說明發酵液中有脂肽存在[12]。TLC分析及顯色反應發現，直接用茚三酮進行染色，不顯色；將薄層板放入裝有濃鹽酸的密封瓶內于 150℃原位水解后，再用茚三酮染色，顯紅色斑點。表明表面活性劑本身不含游離氨基，酸解后可產生游離氨基[13]，確定發酵液中含有脂肽類表面活性劑。

表面活性劑的紅外光譜分析結果見圖3。

圖3 樣品的FTIR圖

在 FTIR譜圖上，3289.6 cm-1是由分子鏈間氫鍵引起的NH收縮振動譜帶,1540.0 cm-1為酰胺譜帶Ⅱ，這表明表面活性劑分子的親水基是肽鏈。2947.7～2857.2 cm-1和1458.7～1374.8 cm-1的兩處吸收峰是脂肪族碳鏈的 C—H伸縮振動峰，1713.7 cm-1和1177.7 cm-1是內酯的特征吸收峰，表明表面活性劑分子的疏水基是脂肪酸半分子。因此，可判定該表面活性劑分子是環脂肽類分子。

紅外光譜測定的圖譜與文獻所載的紅外光譜圖有所不同[9]，可能是樣品不純所致，也可能產生的是一種新型脂肽。

菌株在含有0.4%葡萄糖基本無機鹽的培養基(pH值為7)中，45℃、170 r·min-1培養不同時間，取樣測定細菌濃度和發酵液的表面張力,結果見圖4。

圖4 細菌濃度和表面張力的關系

由圖4可看出，發酵前培養基的表面張力為69.56 mN·m-1，發酵后表面張力為29.36 mN·m-1。隨著細菌濃度的增加，表面張力逐漸降低,說明表面活性劑的產量逐漸升高，但是產量的最大值出現在細菌濃度的最大值之后，這說明表面活性劑是細菌的次級代謝產物，細菌在生長遲滯期大量分泌表面活性劑[14]。

3 結論

從克拉瑪依油田油水樣中分離得到3株產生物表面活性劑的菌株，經分子生物學鑒定，其中一株與土壤芽孢桿菌同源關系最近，能夠在基本無機鹽培養基中以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的條件下生長，其代謝產物為脂肽類生物表面活性劑。

該菌株代謝產物具有降低表面張力的能力，可以將發酵液的表面張力從69.56 mN·m-1降低到29.36 mN·m-1，對煤油具有較高的乳化活性。該菌株在微生物采油上具有較大的應用潛力。

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