氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶的影響

在高密度培養(yǎng)重組大腸桿菌以高表達PNPase的工藝中，氮源對發(fā)酵有著重要的影響。有機氮源中存在著非常豐富的氨基酸。目前，國內(nèi)外已有很多報道各種氨基酸對重組大腸桿菌高效表達目的蛋白的影響。作者在此采用單因素方差分析和粗糙集分析，考察了氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)PNPase的影響。

1 實驗

1.1 菌種

E.coliBL21/pET28a-PNP，卡那霉素抗性，PNP來源于產(chǎn)氣腸桿菌，自行構建。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB)：蛋白胨10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1。

M9基礎培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 12.8 g·L-1，KH2PO43 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，NH4Cl 1 g·L-1，MgSO40.002 mol·L-1，葡萄糖0.5%，CaCl20.0001 mol·L-1。

合成培養(yǎng)基：M9基礎培養(yǎng)基+不同濃度的各種游離氨基酸。

復合培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 14.26 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，NaCl 7 g·L-1，蛋白胨12 g·L-1,酵母粉 6 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1,CaCl20.05 g·L-1，甘油 15 g·L-1。

以上培養(yǎng)基在接種前加入終濃度為30 μg·L-1的卡那霉素。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面上切適當大小的菌體瓊脂塊接種到已經(jīng)加入卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：以5%的接種量于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的IPTG誘導3 h，發(fā)酵結束，得發(fā)酵液。

1.4 分析方法

1.4.1OD600的測定

將發(fā)酵液稀釋適當倍數(shù)，用752-C型分光光度計在600 nm測其光吸收值。

1.4.2 PNPase酶活的測定

取20 μL濃度為100 g·L-1的菌液，放入200 μL含3 μmol肌苷的磷酸鈉緩沖溶液中，于37℃、 pH值7.0條件下反應1 h，100℃煮沸5 min使酶滅活，13 000 r·min-1離心2 min，取上清稀釋10倍，用高效液相色譜測定次黃嘌呤的含量[3]。高效液相色譜條件為：流動相10%甲醇，C18柱，柱溫40℃，檢測波長254 nm。以每毫升發(fā)酵液每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1 μmol次黃嘌呤的量為1個酶活力單位(U)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與討論

2.1 合成培養(yǎng)基中氨基酸對PNPase總酶活的影響

2.1.1 合成培養(yǎng)基中氨基酸濃度的確定

微生物的氮的同化代謝中，轉(zhuǎn)氨的供體來自谷氨酸(Glu)與谷氨酰胺(Gln)[4]，所以在合成培養(yǎng)基中采用谷氨酰胺來確定氨基酸添加的濃度。添加不同濃度谷氨酰胺，得到的PNPase總酶活見表1。

表1 添加不同濃度Gln的總酶活

由表1可知，隨著Gln濃度的增加，總酶活相應上升。當Gln濃度為0.2 g·L-1時，總酶活為20.3 U·mL-1。由于此酶活升高與降低均有較大空間，故采用0.2 g·L-1作為各種氨基酸添加的最終濃度。

2.1.2 合成培養(yǎng)基中各種氨基酸對總酶活的影響[5]

在M9基礎培養(yǎng)基內(nèi)分別添加終濃度為0.2 g·L-1的14種氨基酸，重復3次，空白對照不添加氨基酸，各氨基酸對應的總酶活如表2所示。

表2 合成培養(yǎng)基中不同氨基酸對應的總酶活/U·mL-1

采用SPSS 11.5軟件對表2中各氨基酸的濃度進行聚類分析，然后將聚類后的結果與各氨基酸對應的總酶活進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，結果見表3。

表3 單因素方差分析結果

由表3可知，PTrp=0.016、PGlu=0.036、PAla=0.015、PGln=0.010，均小于0.05，故在合成培養(yǎng)基中，Trp、Glu、Ala、Gln可能在重組大腸桿菌高密度高表達PNPase的過程中起關鍵性作用，Glu與Gln是微生物的氮的同化代謝中轉(zhuǎn)氨的供體；Ala分解代謝途徑較為廣泛；Trp在分解代謝中能夠生成非常豐富的碳架復合物[6]，所以添加這幾種氨基酸可能對于高效表達PNPase起著很重要的作用。

2.2 復合培養(yǎng)基中氨基酸對PNPase總酶活的影響

2.2.1 復合培養(yǎng)基中氨基酸濃度的確定及對總酶活的影響

固定總氮含量，設計了14種不同氨基酸含量的有機氮源培養(yǎng)基。采用凱氏定氮法測定不同廠家生產(chǎn)的蛋白胨、酵母粉的總氮含量，采用日立氨基酸自動分析儀測定各原料中各種氨基酸的濃度。由于采用酸水解法水解樣本，因此最終不能檢測出樣本中Gln的濃度。除Gln外，復合培養(yǎng)基中其余13種氨基酸的濃度及其所對應的總酶活如表4所示。

表4 復合培養(yǎng)基中不同氨基酸濃度及對應的總酶活

2.2.2 氨基酸聚類分析及粗糙集分析

運用SPSS 11.5軟件中的K-Means聚類分析法對表4數(shù)據(jù)按照數(shù)值大小進行分類，結果如表5所示。

表5 各氨基酸及對應總酶活的聚類分析結果

由表5可知，粗糙集分析[7]得到Gly和Ala為核屬性，即在復合培養(yǎng)基中，這兩種氨基酸可能在大腸桿菌產(chǎn)PNPase的發(fā)酵過程中起著關鍵作用。

2.2.3 Gly和Ala對總酶活的影響

復配一種Gly和Ala含量相對都較低而其它氨基酸含量相對較高的復合氮源，然后分別添加不同濃度的Gly或Ala來確證兩種氨基酸對總酶活的影響，結果如表6所示。

表6 添加不同濃度的Gly或Ala的總酶活/U·mL-1

從表6可以看出，Gly和Ala均對酶活有促進作用。當Gly濃度在80～140 mg·L-1時的總酶活較高，而Ala濃度為140～200 mg·L-1時的總酶活較高。因此同時添加兩種氨基酸，兩者的終濃度均為140 mg·L-1，對應總酶活為28 U·mL-1，比單獨添加兩種氨基酸的總酶活均有明顯提高，說明Gly和Ala對酶活的影響存在交互作用。

2.3 驗證實驗

根據(jù)實驗結果，設計了一種各種氨基酸含量均較低的復合培養(yǎng)基，通過單獨添加Trp、Ala、Glu、Gln、Gly(終濃度均為0.2 g·L-1)或同時添加Ala、Gly(終濃度均為0.14 g·L-1)，考察氨基酸對總酶活的影響，結果如圖1所示。

圖1 添加各種氨基酸與對照組的總酶活

從圖1可以看出，和對照組相比，在復合培養(yǎng)基中單獨添加Glu、Trp，總酶活沒有提高;單獨添加Gln、Ala、Gly，總酶活略有提高；共同添加Ala和Gly能明顯提高總酶活。由此說明Ala和Gly能夠共同促進PNPase在大腸桿菌BL21內(nèi)大量表達，在PNPase的發(fā)酵生產(chǎn)中起著關鍵性作用。這可能是由于產(chǎn)氣腸桿菌中PNPase的氨基酸序列中Ala和Gly的含量較高[8]，在各種氨基酸都有一定含量的復合培養(yǎng)基中， 添加Ala和Gly能夠促進PNPase的高效表達。同時也反映單因素方差分析得到合成培養(yǎng)基中的關鍵性氨基酸不能成為復合培養(yǎng)基中重組大腸桿菌高密度高表達PNPase的關鍵性氨基酸，但合成培養(yǎng)基的單獨添加氨基酸的實驗方法可能適合于PNPase的高效表達的機制研究。

3 結論

采用單因素方差分析，考察了合成培養(yǎng)基中各種氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶總酶活的影響；同時采用聚類分析和粗糙集分析，考察了復合培養(yǎng)基中氨基酸對大腸桿菌BL21產(chǎn)嘌呤核苷磷酸化酶總酶活的影響。結果表明，在合成培養(yǎng)基和復合培養(yǎng)基中對總酶活影響顯著的是不同的氨基酸。在復合培養(yǎng)基中，丙氨酸和甘氨酸對產(chǎn)酶有明顯促進作用且存在交互作用，兩者濃度分別控制在80～140 mg·L-1和140～200 mg·L-1之間能夠很好地保證發(fā)酵產(chǎn)量。

參考文獻：

[1] Tong K I，Yamamoto M，Tanaka T.A simple method for amino acid selective isotope labeling of recombinant proteins inE.coli[J].J Biomol NMR，2008，42(1):59-67.

[2] Lewkowicz E S，Martinez N,Rogert M C,et al.An improved microbial synthesis of purine nucleosides[J].Biotechnology Letters, 2000， 22(16): 1277-1280.

[3] 馬泗莊，劉改香，趙洪寧，等.反相高效液相色譜法測定肌苷及其藥物動力學的觀察[J].國外分析儀器技術與應用，1998，(4)：53-55.

[4] Leigh John A， Dodsworth Jeremy A. Nitrogen regulation in bacteria and archaea[J]. Annu Rev Microbiol，2007， 61:349-377.

[5] 劉剛，劉必成，付水林，等.培養(yǎng)基中無機鹽對紅霉素A含量的影響[J].化學與生物工程，2009，26(8)：80-82.

[6] 王敬巖，朱圣庚，徐長法.生物化學(下冊，第三版)[M].北京：高等教育出版社，2002：319-320.

[7] 宋云平，劉必成，于臻，等.粗糙集在紅霉素培養(yǎng)基優(yōu)化中的應用[J].化學與生物工程，2007，24(11)：61-63.

[8] Agnieszka Bzowska, Ewa Kulikowska, David Shugar. Purine nucleoside phosphorylases: Properties, functions, and clinical aspects[J].Pharmacology & Therapeutics， 2000，88(3)：349-425.