殼聚糖對桑葉水提液的絮凝工藝研究

桑葉為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉，其藥用價值最早見于《神農本草經》，性味甘、苦、寒，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的作用，主要用于風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等癥的治療[1]。現代藥理研究發現，桑葉具有降血糖、降血脂、降血壓、調節免疫、抗腫瘤、延緩衰老、抗凝血、抑菌、抗炎等多種藥理活性，其主要藥效成分是黃酮和多糖。我國桑葉資源較豐富，在藥品和功能性食品方面有著廣闊的研究與開發前景。

殼聚糖具有良好的生物降解性和生物可溶性，既能除去雜質，又能保證藥液或制劑穩定，已廣泛應用于中藥藥液及制劑的澄清精制[2～4]。殼聚糖作為一種新型的天然絮凝劑，其澄清作用機理是利用電荷和大分子的架橋作用，去除溶液中的不溶性顆粒和鞣質、蛋白質、樹脂等雜質，得到澄清的溶液[5,6]。

作者在此采用殼聚糖絮凝桑葉水提液，以有效成分總黃酮和總多糖含量為指標對絮凝工藝進行全面考察，篩選出了最佳絮凝工藝條件。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

干桑葉(批號：20070920)，河北安國京興藥業有限責任公司。

葡萄糖，天津北方天醫化學試劑廠；蘆丁對照品，中國藥品生物制品檢定所；殼聚糖，上海偉康生物制品有限公司；其余試劑均為分析純。

KDM型調溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；FA1004型電子天平、UV762型紫外可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀，上海亞榮儀器廠；PHS-25型pH計，上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠；電子恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 桑葉水提液的制備

稱取桑葉100 g，加水煎煮2次，第1次加入10 BV水，煎煮2 h；第2次加入8 BV水，煎煮1 h。合并兩次濾液，減壓濃縮至規定濃度，即得桑葉水提濃縮液，用時加水稀釋。

1.2.2 殼聚糖溶液的制備

用1%的冰醋酸溶液配制1%的殼聚糖溶液，充分溶脹后作為絮凝劑立即使用，以免在稀酸中緩慢水解而影響絮凝效果。

1.2.3 殼聚糖絮凝桑葉水提液

量取桑葉水提液適量，調pH值至規定值，加入一定量殼聚糖溶液，攪拌10 min，在一定水浴溫度下放置一段時間，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總多糖和總黃酮含量。

1.2.4 多糖標準曲線繪制及樣品中總多糖含量測定

葡萄糖對照品溶液的配制：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，即得1 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液，搖勻，備用。

蒽酮試劑的配制：精密稱取0.2 g蒽酮溶于100 mL 72%硫酸中(須臨用新配)。

多糖標準曲線的繪制：精密吸取葡萄糖對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻。精密吸取該溶液1.0 mL置于具塞試管中，沿試管壁分別加入5 mL 0.2%蒽酮試劑，混勻，蓋上玻璃塞；置沸水浴中加熱10 min，取出；在冷水浴中冷卻20 min；在626 nm處，以空白試劑調零，測定各溶液的吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程A=4.845c+0.019，R2=0.999，線性范圍為0.2～1.4 mg·mL-1。

樣品液總多糖含量的測定：將絮凝后濾液減壓濃縮，冷卻，加入95%乙醇至醇含量達75%，其間不斷攪拌，有大量沉淀生成，離心，收集沉淀；分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌， 得到粗多糖。粗多糖用適量熱蒸餾水溶解后，放冷；轉移至50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻。精密吸取該溶液1.0 mL于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，待測。從各組桑葉多糖供試液中分別精密吸取1.0 mL，置于具塞試管中，按照“多糖標準曲線的繪制”項下的方法測定吸光度，并根據多糖標準曲線計算樣品液中總多糖的含量。

1.2.5 黃酮標準曲線繪制及樣品中總黃酮含量測定

蘆丁對照品溶液的制備：精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg，置于100 mL燒杯中，加適量60%乙醇，水浴微熱，使之溶解，放冷，轉移至100 mL容量瓶中，加入60%乙醇至刻度，即得0.2 mg·mL-1蘆丁對照品溶液，搖勻，備用。

黃酮標準曲線的繪制[7,8]：精密吸取蘆丁對照品溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中； 加30%乙醇5 mL、5% NaNO2溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min； 加10% Al(NO3)3溶液0.7 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH溶液10 mL，再加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min；在波長510 nm處，以空白溶液作參比，測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程A=12.782c-0.0519，R2=0.999，線性范圍為0.2～1.0 mg·mL-1。

樣品液總黃酮含量的測定：精密吸取絮凝后濾液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加30%乙醇定容，搖勻。精密吸取該溶液5.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按照“黃酮標準曲線的繪制”項下的方法測定吸光度，并根據黃酮標準曲線計算樣品液中總黃酮的含量。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 殼聚糖加入量對絮凝效果的影響

取桑葉水提濃縮液適量，加水稀釋至桑葉水提液質量體積比為1∶10(g∶mL，下同)，調pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，分別按0.4 mL·g-1(殼聚糖溶液體積/生藥量，下同)、0.8 mL·g-1、1.2 mL·g-1、1.6 mL·g-1、2.0 mL·g-1加入不同量的殼聚糖溶液，攪拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總黃酮和總多糖含量。結果見圖1。

圖1 殼聚糖加入量對總黃酮和總多糖含量的影響

由圖1可看出，隨著殼聚糖加入量的增加，總多糖與總黃酮的含量均有所上升，但當殼聚糖加入量大于1.2 mL·g-1時，總多糖和總黃酮含量均有所下降。這是因為隨著殼聚糖加入量的增加，殼聚糖與蛋白質、鞣質等雜質分子發生吸附架橋和電中和的機會增大，使得蛋白質、鞣質等雜質分子被大量絮凝沉淀，提高了總黃酮和總多糖的含量；但是，隨著殼聚糖用量的進一步增加，過多的絮凝劑可能引起藥液自身穩定性被破壞，黃酮和多糖等有效成分隨大分子物質一起沉降，導致含量降低。因此，殼聚糖加入量以1.2 mL·g-1為宜。

2.1.2 桑葉水提液質量體積比對絮凝效果的影響

取桑葉水提濃縮液適量，加水稀釋至桑葉水提液質量體積比為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(藥液體積按每份含生藥12.5 g進行調整)，調pH值至6.0，按1.2 mL·g-1加入殼聚糖溶液，攪拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總黃酮和總多糖含量。結果見圖2。

圖2 桑葉水提液質量體積比對總黃酮和總多糖含量的影響

由圖2可看出，隨著桑葉水提液質量體積比的降低，總多糖與總黃酮含量逐漸增加。這是因為當桑葉水提液質量體積比較高時，有效成分可能被所形成的沉淀吸附、包裹，使得總多糖和總黃酮含量降低；但桑葉水提液質量體積比小于1∶10時，隨質量體積比的降低，總多糖和總黃酮含量反而降低，這與殼聚糖濃度降低，影響了藥液絮凝效果有關。因此，桑葉水提液質量體積比以1∶10為宜。

2.1.3 藥液pH值對絮凝效果的影響

取桑葉水提濃縮液適量，加水稀釋至桑葉水提液質量體積比為1∶10，平行5份，每份100 mL，調pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，按1.2 mL·g-1加入殼聚糖溶液，攪拌10 min，于45℃水浴中放置3 h，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總黃酮和總多糖含量。結果見圖3。

圖3 藥液pH值對總黃酮和總多糖含量的影響

由圖3可看出，當藥液pH值小于6.0時，總黃酮和總多糖含量均隨pH值的增大而增加。這是因為pH值較低時部分多糖在酸性條件下水解，殼聚糖的-NH2與H+結合，影響了殼聚糖的絮凝沉淀作用，此時增大pH值對絮凝有利。當藥液pH值大于6.0時，隨著pH值的增大，藥液中的負電荷增加，減弱了殼聚糖的電中和作用，影響了絮凝作用的發生，總黃酮和總多糖含量迅速下降。因此，藥液pH值以6.0為宜。

2.1.4 水浴溫度對絮凝效果的影響

取桑葉水提濃縮液適量，加水稀釋至桑葉水提液質量體積比為1∶10，調pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，按1.2 mL·g-1加入殼聚糖溶液，攪拌10 min，分別于25℃、35℃、45℃、55℃、65℃恒溫水浴中放置3 h，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總黃酮和總多糖含量。結果見圖4。

圖4 水浴溫度對總黃酮和總多糖含量的影響

由圖4可看出，隨著水浴溫度的升高，溶液中的膠體顆粒與殼聚糖分子相互碰撞的幾率增大，加速了絮凝沉淀的形成，有利于藥液的絮凝作用，總黃酮和總多糖含量相應增加；但是，當水浴溫度過高時，形成的絮凝體細小，絮凝團體積大，含水量高，難于處理，易使殼聚糖高分子發生老化，影響絮凝效果。因此，水浴溫度以45℃為宜。

2.1.5 絮凝時間對絮凝效果的影響

取桑葉水提濃縮液適量，加水稀釋至桑葉水提液質量體積比為1∶10，調pH值至6.0，平行5份，每份100 mL，按1.2 mL·g-1加入殼聚糖溶液，攪拌10 min，分別于45℃水浴中放置1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，離心15 min(3000 r·min-1)，濾過，取濾液測定總多糖和總黃酮含量。結果見圖5。

圖5 絮凝時間對總黃酮和總多糖含量的影響

由圖5可看出，隨著絮凝時間的延長，殼聚糖與藥液中的膠體顆粒、蛋白質等雜質作用時間延長，殼聚糖的絮凝作用充分，形成穩定的沉淀，總黃酮和總多糖含量相應增加；絮凝時間超過3 h后，總黃酮和總多糖的含量維持穩定,這是因為殼聚糖的作用達到了平衡，再延長絮凝時間對有效成分含量的提高無明顯改善。因此，絮凝時間以3 h為宜。

2.2 正交實驗[8]

根據單因素實驗結果，絮凝時間對絮凝效果的影響較小，因而，分別以殼聚糖加入量、桑葉水提液質量體積比、水浴溫度、藥液pH值為考察因素，進行L9(34)正交實驗，以確定殼聚糖的最佳絮凝條件。結果與分析見表1。

表1 正交實驗結果與分析

由表1可知，各因素對絮凝效果的影響大小依次為：殼聚糖加入量>藥液pH值>桑葉水提液質量體積比>水浴溫度。綜合考慮各因素，選擇最佳工藝條件為A2B2C2D1，即殼聚糖加入量1.2 mL·g-1、桑葉水提液質量體積比1∶10、藥液pH值6.0、水浴溫度35℃。

2.3 驗證實驗

就最佳工藝條件下殼聚糖對桑葉水提液的絮凝效果進行驗證，結果見表2。

由表2可知，在最佳工藝條件下，總多糖和總黃酮含量及綜合評分均有所增加，說明所確定的最佳工藝條件適合桑葉有效成分的提取。

表2 驗證實驗結果/mg·mL-1

3 結論

通過單因素實驗和正交實驗，確定殼聚糖絮凝精制桑葉水提液的最佳工藝條件為：桑葉水提液質量體積比1∶10(g∶mL)、藥液pH值6.0、殼聚糖加入量1.2 mL·g-1、水浴溫度35℃、絮凝時間3 h。在此條件下，總黃酮和總多糖的平均含量分別為27.46 mg·mL-1、51.15 mg·mL-1，綜合評分為39.32 mg·mL-1，說明此最佳工藝有利于桑葉水提液有效成分的提取。

參考文獻：

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