PEG-(NH4)2SO4雙水相萃取法提取殼聚糖酶的研究

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(武漢生物工程學院生物工程系，湖北 武漢 430415)

殼聚糖酶(Chitosanase，EC3.2.2.99)又稱殼聚糖-N-乙酰-氨基葡糖苷水解酶，是一種分解殼聚糖的專一性酶，廣泛分布在細菌、真菌、病毒以及植物等生物群中[1]。酶降解法制備殼寡聚糖具有反應條件溫和、寡糖得率高、不污染環境、產物安全性高等優點，是目前的發展方向。因此，對殼聚糖酶進行深入研究并實現工業化生產十分必要。

雙水相萃取(ATPS)是近年來發展起來的技術，在蛋白質、酶、核酸等生物活性物質的分離純化方面受到廣泛重視。與傳統的分離方法相比，ATPS具有條件溫和、產品活性損失小、處理量大、分離步驟少、無有機溶劑殘留、設備投資小、操作簡單、易于工程放大和連續操作等優點，非常適合大規模應用[2，3]。

目前國內對雙水相萃取法提取殼聚糖酶的研究和報道較少。作者利用PEG-(NH4)2SO4雙水相體系從Bacillussp.LS發酵液上清液中萃取分離殼聚糖酶，考察了影響萃取效果的各種因素，對雙水相萃取技術提取殼聚糖酶進行了初步研究。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與儀器

菌種Bacillussp.LS，自行篩選得到。

殼聚糖，成都科龍化工試劑廠；聚乙二醇(PEG，分子量為400、600、1000、4000、6000)、硫酸銨、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、考馬斯亮藍G250、D-(+)-氨基葡萄糖鹽酸鹽等均為分析純。

BS110S型電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；GL-16G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；722S型分光光度計，上海棱光技術有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海宇隆儀器有限公司；WH-90A型漩渦混合器，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備

低溫保藏的菌種經過活化后，接種于液體發酵培養基中搖床培養，發酵液經冷凍離心后，收集上清液，4℃貯存備用。

1.2.2 PEG-(NH4)2SO4雙水相體系的建立

稱取一定量PEG和(NH4)2SO4配制雙水相體系。體系總質量為10.0 g，其中酶液量為2.0 g，不足部分用去離子水補足?；旌暇鶆蚝?，3000 r·min-1離心5 min，分相。分別測定上、下相體積，上、下相酶活和總蛋白濃度。計算相比(上、下相體積之比，R)、分配系數(上、下相酶比活力之比，K)、萃取率(上相總酶活與兩相總酶活之比，S)。

1.2.3 雙水相體系相圖的繪制

準確量取一定量的PEG原液加入試管中，然后計量加入(NH4)2SO4溶液，混合，直至試管出現混濁。計量，算出PEG和(NH4)2SO4在系統中的質量分數。再計量加入適量水，使體系變澄清，并繼續加入(NH4)2SO4溶液，使系統再次變混濁。如此反復操作，計算達到混濁時PEG和(NH4)2SO4在系統中的質量分數，繪制PEG-(NH4)2SO4體系的相圖。

1.3 分析與測試

1.3.1 酶活的測定

在1 mL1%膠體殼聚糖(用0.2 mol·L-1pH值5.0的醋酸緩沖溶液配制)中加入1 mL適當稀釋的酶液，于50℃保溫反應15 min，沸水浴10 min滅活，加入DNS 1.5 mL，沸水浴10 min，取出冷卻，3500 r·min-1離心15 min，取上清液在520 nm處測光吸收值。酶活單位定義為每分鐘催化生成相當于1 μmol氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.3.2 蛋白質含量測定

蛋白質含量用考馬斯亮藍法測定[4]。

2 結果與討論

2.1 雙水相體系相圖(圖1)

圖1 PEG600-(NH4)2SO4雙水相體系相圖

由圖1可見，在節線的上方區域可以形成雙水相。

2.2 PEG相對分子量對殼聚糖酶萃取效應的影響[5]

固定PEG的質量分數為20%、(NH4)2SO4的質量分數為15%，考察PEG相對分子量對殼聚糖酶萃取效應的影響，結果見圖2。

圖2 PEG相對分子量對殼聚糖酶萃取效應的影響

由圖2可知，隨著PEG相對分子量的增加，殼聚糖酶的分配系數和萃取率均先增大后減小，當PEG相對分子量為600時分配系數和萃取率均達到最大。因此，選擇PEG600進行后續實驗。

2.3 PEG質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響

固定(NH4)2SO4的質量分數為15%，考察PEG600質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響，結果見圖3。

圖3 PEG600質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響

由圖3可知，(NH4)2SO4質量分數一定時，隨著PEG600質量分數的增加，分配系數和萃取率均先增大后減小。這是因為隨著PEG600質量分數的增加，上相和下相相對組成的差別增大，殼聚糖酶在兩相中的表面張力差別也增大，有利于殼聚糖酶富集于上相中。但PEG600質量分數增加到一定程度時，成相物質間的作用增大，相界面張力亦增大，系統粘度也會增大，溶質在相間的傳遞和在相內的擴散阻力大大增加[6]，反而不利于殼聚糖酶進入PEG相。綜合考慮，確定最佳的PEG600質量分數為20%。

2.4 (NH4)2SO4質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響

固定PEG600的質量分數為20%，考察(NH4)2SO4質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響，結果見圖4。

圖4 (NH4)2SO4質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響

由圖4可知，PEG600質量分數一定時，隨著(NH4)2SO4質量分數的增加，分配系數和萃取率均先增大后減小。(NH4)2SO4質量分數為20%時，分配系數和萃取率均達到最大值。隨著(NH4)2SO4質量分數繼續增加，影響到蛋白質表面的疏水性，進而影響到蛋白質的分配系數。因此，確定最佳(NH4)2SO4質量分數為20%。

2.5 離子強度對殼聚糖酶萃取效應的影響(圖5)

圖5 NaCl質量分數對殼聚糖酶萃取效應的影響

由圖5可知，隨著NaCl質量分數的增大，分配系數和萃取率先增大后減小，NaCl質量分數為0.1%時，均達到最大值。這是因為，NaCl粒子可能在兩相中有不同的分配系數，隨著NaCl質量分數的增加，兩相間電位差發生變化，從而使殼聚糖酶的分配系數增加，但增加到一定的程度(超過0.1%)后，萃取相極性增強，殼聚糖酶的溶解度下降而發生鹽析現象，蛋白質傾向于分配到下相，分配系數和萃取率明顯下降。因此，確定最佳NaCl質量分數為0.1%。

2.6 pH值對殼聚糖酶萃取效應的影響(圖6)

由圖6可知，隨著pH值的增加，分配系數和萃取率均先增大后減小，pH值為6.0時，均出現最大值。體系pH值對殼聚糖酶的分配有很大影響，這是由于體系pH值的變化能明顯改變兩相的電位差[7]， 最終影響到殼聚糖酶的分配系數和萃取率。因此， 確定萃取分離殼聚糖酶的雙水相體系的最佳pH值為6.0。

圖6 pH值對殼聚糖酶萃取效應的影響

3 結論

室溫下用PEG-(NH4)2SO4雙水相體系從Bacillussp.LS發酵液上清液中萃取殼聚糖酶，最佳提取條件為：PEG600質量分數20%、(NH4)2SO4質量分數20%、NaCl 質量分數0.1%、pH值6.0，在此條件下殼聚糖酶分配系數達5.91、萃取率達88.7%。

參考文獻：

[1] 吳曉宗，王歲樓，郝莉花.殼聚糖酶的分類及其功能應用現狀[J].食品工業科技，2005，26(8)：189-192.

[2] Diamond A D,Hsu J T.Aqueous two-phase systems for biomolecule separation[J].Advances in Biochemical Engineering Biotechnology,1992,47:89-135.

[3] Schmid A S,Ventom A M,Asenjo J A,et al.Partitioning and purification ofα-amylase in aqueous two-phase systems[J].Enzyme and Microbial Technology,1994,16(2):131-142.

[4] 陳毓荃.生物化學實驗方法和技術[M].北京：科學出版社，2002：95-96.

[5] 鄧靜，吳華昌，趙樹進.雙水相技術在酶分離純化中的運用[J].氨基酸和生物資源，2004，26(1)：72-75.

[6] 馮箐，夏杰，陸兵，等.人溶菌酶的雙水相萃取法分離[J].華東理工大學學報，2006，32(12)：1409-1411.

[7] 楊善升，陸文聰，包伯榮.水相萃取技術及其應用[J].化學工程師，2004，18(4):37-40.