纖維素分解菌的篩選及其紫外誘變

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(東南大學化學化工學院,江蘇 南京 210009)

纖維素是植物細胞壁的主要成分，約占植物干重的30%～50%，是自然界中分布最廣的天然高分子化合物，也是地球上數量最豐富、最廉價的可再生資源[1,2]。自然界中廣泛存在產纖維素酶的微生物，包括細菌、真菌、放線菌等。微生物產生的纖維素酶已經用于纖維素類生物質生產葡萄糖、飼料工業、紡織行業、環境保護、農產品加工等方面[3]。直接從環境中選育出來的野生型菌株產纖維素酶活性不高，菌種易退化，限制了其應用范圍。因此，選育高產纖維素酶活性的微生物類群是人們研究的熱點之一。作者從朽木、腐爛的竹葉和稻草中分離得到8株纖維素分解菌，并對其中酶活較高的菌株進行了紫外線誘變。

1 實驗

1.1 材料與試劑

朽木、腐爛的竹葉與稻草從自然界中采集。

DNS試劑，pH值7.2的緩沖溶液，1%羧甲基纖維素鈉(CMCNa)磷酸緩沖溶液。

1.2 培養基

霉菌斜面培養基:馬鈴薯200 g, 蔗糖20 g, 瓊脂17 g, 蒸餾水1000 mL, pH值自然。

羧甲基纖維素鈉培養基:(NH4)2SO42 g, MgSO40.5 g, KH2PO41 g, NaCl 0.5 g, 羧甲基纖維素鈉10 g, 瓊脂17 g, 蒸餾水1000 mL, pH值自然。

產酶液體培養基: 麥草粉40 g, 麥麩10 g,(NH4)2SO41.5 g, KH2PO41.0 g, MgSO40.5 g, NaCl 0.2 g, CaCl20.2 g, 蒸餾水1000 mL。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與初篩

朽木、腐爛的竹葉與稻草等分別放入錐形瓶中，加入適量的滅菌生理鹽水，振蕩30 min，靜置，各吸取上清液1 mL，分別稀釋10、102、103倍，涂布在羧甲基纖維素鈉培養基上，30℃培養7 d，挑取大的單菌落進行劃線分離。將分離得到的菌株接種于新的羧甲基纖維素鈉培養基上培養3 d，用剛果紅染色法[3]測定菌落直徑及透明圈直徑，對其中8株產酶活性較高的菌株進行酶活性測定，從中篩選出產酶活性最高的菌株。

1.3.2 2#菌株孢子懸液制備

將初篩得到的2#菌株接種到霉菌斜面培養基上活化3 d，用無菌生理鹽水洗下孢子，打散后用血球計數板計數，稀釋孢子液濃度至1×106～1×108個·mL-1，得孢子懸液。

1.3.3 紫外線誘變處理

打開紫外燈將無菌操作箱滅菌20 min。取 8 個直徑9 cm培養皿，每皿中加入5 mL孢子懸液，在20 W紫外燈下30 cm處分別照射0 s、6 s、12 s、18 s、24 s、30 s、40 s、50 s，將經過照射的孢子懸液適當稀釋后涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，黑布包好后置于30℃恒溫培養箱中培養3 d。菌落計數，繪制存活曲線。

1.3.4 突變株的篩選

選擇致死率為60%～90%的紫外線劑量誘變。將誘變后的孢子懸液適當稀釋后涂布于羧甲基纖維素鈉平板上，按初篩方法篩選出產酶活性較高的突變株。將其接入產酶液體培養基中30℃培養3 d。用DNS比色法測定酶活性，進一步篩選出產酶活性較高的突變株，接種于斜面上，置于冷藏室保存。

1.3.5 纖維素分解菌的酶活性測定[4，5]

將菌株接種于產酶液體培養基中搖床培養3 d，培養液在3500 r·min-1離心10 min，上清液即為初酶液。移取含有1% CMCNa的磷酸緩沖溶液1.5 mL于試管中，加人初酶液0.5 mL，于50℃水浴中保溫20 min后，按DNS法測糖含量。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

采用DNS法[4]，在波長為530 nm條件下，測定一系列已知濃度葡萄糖的OD值，繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 菌株的初篩

涂布了樣品水溶液的羧甲基纖維素鈉培養基培養7 d后，培養基上長出很多大小不同的菌株，菌株顏色有乳白色、淺綠色、墨綠色、灰白色、黑色等。觀察菌株形態，大部分為霉菌。用剛果紅染色法選取8株透明圈直徑(D2)和菌落直徑(D1)的比值相對較大的菌株，結果見表1。

表1 8株菌株的透明圈直徑和菌落直徑

測定上述8株菌株的酶活性，結果見表2。

表2 8株菌株酶活性測定結果

從表2可以看出，2#、6#和8#菌的OD值及產酶活性較高，尤其是2#，這與剛果紅染色法結果一致。但對于3#、4#、7#菌，剛果紅染色法與OD法測定的酶活性大小不同。所以僅以D2/D1值作為菌株產纖維素酶活性大小的唯一定量指標不可靠。因為不同菌種、生長條件、纖維素酶系、產酶速度、菌苔大小及在平板上堆積情況的差異都可能造成D2/D1值與產酶活性結果的不完全一致[6]。綜合兩種方法結果，選擇2#菌株進行紫外線誘變。

2.3 2#菌株紫外誘變存活率曲線(圖2)

圖2 存活率與紫外線照射時間的關系

從圖2可以看出，在0～50 s照射時間內，隨著紫外線照射時間的延長，2#菌存活率迅速下降。照射時間為5 s、6 s、12 s、19 s時其致死率分別為60%、70%、80%、90%。

2.4 突變株的篩選

以致死率60%～90%的紫外線劑量誘變2#菌株，得到了一系列突變株，結果見表3。

表3 致死率為60%～90%的突變株篩選情況

從表3可以看出，致死率為80%的M10菌株在所有突變株中產酶活性最大，其產酶活性相對于出發菌株提高了89.1%。

3 結論

(1)利用羧甲基纖維素鈉為唯一碳源培養基從朽木、腐爛的竹葉與稻草中分離得到8株纖維素分解菌，測定了其產酶活性。對其中產酶活性較高的2#菌株進行紫外線誘變，進一步篩選得到突變株M10，相對酶活較出發菌株提高了89.1%。

(2)實驗中發現，以水解圈直徑/菌落直徑比值判斷菌株產纖維素酶活性大小并不可靠，需要進一步測定酶活。

參考文獻：

[1] Munisiwaran P K A，Charyulu N C L N. Solid substrate fermentation of coconut coir pith for cellulase production[J].Enzyme Microb Technol，1994，16(5)：436-440.

[2] Peter M，Zarnea G,Adrian P，et al. Biodegradation and bioconversion of cellulose wastes using bacterial and fungal cells immobilized in radiopolymerized hydrogels[J].Resources，Conservation and Recyling，1999，27(5)：309-332.

[3] 劉春芬，賀稚非，蒲海燕，等.纖維素酶及應用現狀[J].糧食與油脂，2004，(1)：15-1.

[4] 魏亞琴，李永泉，李紅玉.分解纖維素的三株真菌的篩選與鑒定[J].蘭州大學學報，2008，44(S1)：92-96.

[5] 傅力.纖維素酶測定方法的研究[J].新疆農業大學學報，2000，25(2)：45-48.

[6] 房興堂.秸稈纖維素分解菌的酶活力測定[J].生物技術通訊，2007，18(4)：628-630.