軟骨微粒脫細胞基質和纖維蛋白凝膠支架皮下構建組織工程軟骨

聶芳菲 潘柏林 李健寧

軟骨微粒脫細胞基質和纖維蛋白凝膠支架皮下構建組織工程軟骨

聶芳菲 潘柏林 李健寧

目的觀察皮下植入異體軟骨細胞復合異種軟骨微粒脫細胞基質（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）和纖維蛋白膠（Fibrin glue，FG）為支架形成組織工程軟骨的可能性。方法制備豬耳廓CMACM，體外培養成年兔的耳軟骨細胞，將不同的混合物植入5只成年兔背部皮下。A組：異體軟骨細胞復合CMACM和FG；B組：自體軟骨細胞復合CMACM和FG；C組：CMACM和FG。將每只兔子背部皮膚均分為6個區，分別植入不同混合物各兩個點，以備兩次取材。觀察并記錄皮下植入體的形態變化，分別于植入后8周和12周取材，行組織學檢測。結果A組和C組未能形成軟骨樣組織。B組8周可以形成軟骨樣組織，周圍炎癥細胞數量較多；12周時形成的軟骨組織成分單一，周圍沒有炎癥反應，類似于正常軟骨，且新生的軟骨組織中均長有許多小血管，新生軟骨的厚度不超過1 mm。結論將同種異體軟骨細胞復合CMACM和FG植入皮下，不能形成軟骨樣組織；而以自體軟骨細胞為種子細胞則可以得到軟骨樣組織，但新生軟骨的體積和厚度有限，并且新生的軟骨組織中長有許多小血管，可能更有利于新生軟骨組織的長期存活。

異體軟骨細胞軟骨微粒脫細胞基質組織工程

脫細胞基質（Acellular matrix，ACM）是指異體組織經過細胞滅活處理后，制備成無活體細胞存在的ECM成分和結構。因其無抗原性且具備良好的生物相容性，使之成為組織工程支架材料的選擇之一。軟骨微粒脫細胞基質（Cartilage microparticle acellular matrix，CMACM）是一種新型的支架材料，與普通的軟骨ACM相比，其總表面積大大增加，且微粒表面粗糙，有效提高了細胞的黏附率，解決了細胞只能在ACM表面生長的局限性。實驗研究表明，將自體軟骨細胞與異體CMACM和纖維蛋白凝膠（Fibrin glue，FG）結合，回植于小型豬皮下，8周后培養出的組織工程化軟骨組織細胞生長良好，具有分泌軟骨基質的功能[1]。由于皮下移植在耳廓重建及鼻整容手術中的應用價值，本研究擬進一步觀察了兔皮下植入異體軟骨細胞復合豬CMACM和FG形成軟骨組織的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器

純品系新西蘭大白兔5只，體重2.5～3 kg，成年，雌雄不限（北京大學第三醫院動物實驗中心）。氯化鉀分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；1∶250胰蛋白酶（Amresco公司，美國）；乙二胺四乙酸（北京鼎國生物技術有限責任公司）；Ⅱ型膠原酶（Invitrogen公司，美國）；DMEM/F12聯合培養基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Hyclone公司，美國）；天繡醫用生物蛋白膠（廣州倍繡生物技術有限公司）。組織粉碎機（珠海北美電器有限公司）；冷凍干燥機（Yamato，日本）；CO2培養箱（Forma Scientific公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 制備CMACM

以豬耳廓軟骨為原料，按照文獻[1]方法制備。

1.3 體外培養兔耳軟骨細胞

在無菌條件下切取實驗兔一側耳軟骨，生理鹽水沖洗干凈，將軟骨組織剪碎成懸液狀；1 000 r/min離心5 min，吸除多余的液體，加入2～3倍體積的0.3%Ⅱ型膠原酶溶液；37℃恒溫振蕩器中振蕩3 h。1 000 r/min離心5 min，吸除上層消化液，用PBS吹打稀釋，150目不銹鋼濾網過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基制成細胞懸液，接種于75 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱中培養，約7～10 d后按1∶4的比例傳代；傳代后生長迅速，約2～3 d后按1∶4的比例再次傳代；約2～3 d后細胞再次長滿瓶底，收集第2代軟骨細胞用于回植。

1.4 軟骨細胞復合CMACM和FG混合物的制備

皮下植入前24 h，預先將適量的CMACM用含20%胎牛血清的DMEM/F12（每100 mg CMACM用5 mL培養基）37℃浸泡24 h。1 000 r/min離心5 min，分別獲取每個植入點所需的細胞和CMACM沉淀；將新鮮配制的0.5 mL纖維蛋白原和0.5 mL凝血酶分別加入準備好的細胞沉淀和CMACM沉淀中，分別混勻。

混合物分類：A組，異體軟骨細胞復合CMACM和FG；B組，自體軟骨細胞復合CMACM和FG；C組，CMACM和FG。每份A或B混合物約含5×107個細胞、50 mg CMACM和1 mL FG；每份C混合物約含50 mg CMACM和1 mL FG。

1.5 皮下植入及植入后觀察

將每只兔子背部皮膚劃分為6個區，分別植入A、B、C組混合物各兩個點。標準化飼養，密切觀察實驗兔的一般情況和皮膚局部反應，觀察并記錄皮下植入體的形態、大小、軟硬度等變化。

1.6 組織學檢測

(2)對于北部灣經濟區資本一體化的測度，下面將從北部灣經濟區區內資本總流量來反映區內金融一體化的發展水平。區內資本總流量使用公式fil=(OFCt+IFCt)/GDPt來計算，通過對北部灣經濟區歷年數據的查閱(本文主要選取2008年—2011年全區GDP和進出口總額)，經過計算得到結果如下：

分別于植入后8周和12周取材，行組織病理學染色，HE染色顯示基本的組織結構；Mallory染色顯示組織中所含結締組織的結構（膠原纖維被染成藍色）；醛品紅染色觀察被染成紫色的彈性纖維；甲苯胺藍和阿爾新蘭染色顯示軟骨基質中的黏多糖成分（糖胺多糖），陽性結果為軟骨基質呈紫色（甲苯胺藍染色）和藍色（阿爾新蘭染色）。

2 結果

2.1 CMACM的性狀與檢測

CMACM呈白色粉末狀，質地較均勻，使用前以完全培養基浸泡成懸液狀。HE染色顯示CMACM紅染，微粒邊緣粗糙，膠原纖維交錯排列，未見軟骨細胞（圖1）。

2.2 軟骨細胞體外擴增

原代細胞為小圓形，傳代后生長迅速。第2代細胞呈圓形、多角形或梭形，有細胞群集現象，仍可見到同源細胞群（圖2）。

2.3 植入物的體內觀察

植入皮下的混合物即刻觀察直徑為2.3 cm，厚約3 mm，質軟。A、B兩組植入后24 h，觸之可隨皮膚移動，質軟；1周左右變硬，具有彈性和韌性，在皮下移動性好；4周時體積明顯縮小，直徑約1 cm；8周時直徑約0.5 cm；12周時呈扁平，幾乎觸摸不到。C組植入后質軟，皮下物邊界不清，2周左右稍硬，直徑約1 cm，4周時幾乎觸摸不到。

圖1 CMACM（HE，100×）

圖2 第2代軟骨細胞（100×）

圖3 A組植入前（HE，100×）

圖4 A組植入后8周（HE，100×）

圖5 C組植入后8周（HE，100×）

圖6 A組植入后12周（HE，100×）

圖7 B組植入后12周（HE，40×）

圖8 B組植入后12周（HE，100×）

圖9 B組植入后12周（Mallory，40×）

植入前，HE染色示FG無色，基質粉染，細胞核呈藍色，證實為混勻的軟骨細胞、CMACM和FG（圖3）。

8周時，A組HE染色顯示軟骨細胞較少，出現大量炎性細胞（圖4），醛品紅、甲苯胺藍和阿爾新蘭的軟骨組織染色陰性；B組軟骨細胞活力旺盛，細胞嗜堿性強，形成的類軟骨樣組織中有血管長入，其旁可見炎性細胞及未被完全吸收的CMACM，醛品紅、甲苯胺藍和阿爾新蘭染色均陽性；C組HE染色示蛋白膠內無任何細胞，分布在蛋白膠內的CMACM周圍有炎性細胞浸潤（圖5）。

12周時，A組中CMACM和細胞均處于被吸收狀態（圖6），醛品紅、甲苯胺藍和阿爾新蘭染色陰性；B組軟骨細胞活力旺盛，細胞嗜堿性強，形成的類軟骨樣組織中有血管長入，其旁未見炎性組織，植入的CMACM已被完全吸收。軟骨組織厚度不超過1 mm，醛品紅、甲苯胺藍和阿爾新蘭染色均呈陽性（圖7～12）；C組已被完全吸收，未找到植入的組織。

圖10 B組植入后12周（醛品紅，40×）

圖11 B組植入后12周（甲苯胺蘭，40×）

圖12 B組植入后12周（阿爾新蘭，40×）

3 討論

目前軟骨細胞復合ACM的研究多聚焦于自體軟骨細胞復合同種異體的ACM上，已經報道的結果均較滿意。但是，尚未見到異體軟骨細胞復合ACM或自體軟骨細胞復合異種ACM的研究報道。

本實驗結果顯示，復合植入自體軟骨細胞、異種CMACM和FG，皮下可以形成軟骨樣組織；而異體軟骨細胞復合異種CMACM和FG的皮下植入，則未能形成軟骨樣組織。其可能的原因有：①移植細胞的異體排斥，對于其機制目前有多種解釋[2]，而通過多種方法，可建立同種異體軟骨細胞的免疫耐受[3－5]。②局部微環境因素影響，已有學者報道異體細胞復合某種支架可以修復關節軟骨缺損[6－7]。③可能與材料的性質及軟骨細胞供體的年齡有關。李景紅等[8]將1月齡兔耳廓軟骨細胞種于PDLLA上形成復合物，6 h后植于兔皮下，18周時可以形成基本接近正常軟骨的新生軟骨。呂威等[9]將出生3～5 d的新西蘭大白兔四肢關節軟骨組織酶解，分離出軟骨細胞，體外擴增后接種到PLA三維可吸收支架上；再將軟骨細胞-PLA復合物移植到成年新西蘭大白兔的背部皮下，經過7周的體內培養，發現軟骨細胞-PLA復合物在同種異體的動物體內形成新生軟骨組織，且隨著植入時間的延長，軟骨基質的分泌增加，炎性細胞的浸潤逐漸減輕。

此外，本實驗結果顯示，即使是自體耳軟骨細胞所形成的植入物，植入后體積也明顯縮小，且新生的軟骨組織厚度不超過1 mm，其中還長入許多小血管，與文獻報道相符，即當組織工程材料的厚度超過1 mm時，其內部的細胞將很難通過滲透作用獲得營養，必須有毛細血管長入才能維持正常代謝[10]。

總之，豬源CMACM不能抵抗成年兔對異體軟骨細胞的排斥反應，但是可以與自體軟骨細胞和FG在皮下共同構建一定厚度的組織工程軟骨。

[1]潘柏林,李健寧,王萍,等.微粒軟骨脫細胞基質復合纖維蛋白凝膠構建軟骨組織工程支架材料的研究[J].中國美容醫學,2008, 17(5):679-682.

[2]Revell CM,Athanasiou KA.Success rates and immunologic responses of autogenic,allogenic,and xenogenic treatments to repair articular cartilage defects[J].Tissue Eng Part B Rev,2009,15(1):1-15.

[3]吳海濤,李采,鐘翠平.環孢霉素A對組織工程軟骨同種異體移植的影響[J].中國眼耳鼻喉科雜志,2004,4(1):6-7.

[4]王樹軍,張惠珍,王穎,等.FasL+組織工程化豬軟骨細胞的同種異體移植[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(14):2605-2608.

[5]胡洪亮,曹誼林,陳婷婷,等.同種異體組織工程化軟骨局部免疫豁免誘導的實驗[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(14): 2757-2760.

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[8]李景紅,黃金中,程友,等.同種異體軟骨細胞直接體內構建組織工程軟骨的實驗研究[J].中國組織工程研究與臨床康復,2004,8 (29):6348-6349.

[9]呂威,張連山,蔡哲,等.同種異體組織工程化軟骨組織形成的初步研究[J].臨床耳鼻咽喉科雜志,2004,18(8):485-487.

[10]王敏,裴海云,裴雪濤.脂肪來源干細胞的多向分化性及其在組織工程中的應用[J].軍事醫學科學院院刊,2009,33(4):381-384.

Preliminary Study on Subcutaneous Tissue-engineered Cartilage with Cartilage Microparticle Acellular Matrix and Fibrin Glue as Scaffold

NIE Fangfei,PAN Bailin,LI Jianning.Department of Plastic Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China.Corresponding author:LI Jianning.

ObjectiveTo evaluate the possibility of formation of subcutaneously implanted tissue-engineered cartilage using allograft chondrocytes mixed with xenogenic cartilage microparticle acellular matrix(CMACM)and fibrin glue（FG）as scaffold.MethodsChondrocytes were isolated from ears of adult New Zealand white rabbits.CMACM from porcine auricle was established and combined with FG and exoteric amplified chondrocytes.The compound was transplanted into the back of rabbits subcutaneously.The experiment was divided into three groups according to compound components。Group A,allograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group B,autograft chondrocytes mixed with CMACM and FG;Group C with CMACM and FG.Five adult rabbits were used，and six regions were divided on the back of every rabbit.Each rabbit was injected compound of group A,B and C in two regions.Specimens were evaluated macroscopically,then harvested and detected histologically at 8 and 12 weeks after operation.ResultsIn group A and C compounds could not form subcutaneous cartilage tissues.While cartilage tissues formed with group B mixtures at 8 weeks;At 12 weeks,new-formed cartilage tissues seemed even more stabilized without inflammatory around it.The size of new-formed cartilage was obviously shrinked with small vessels growing into it and the thickness of new-formed cartilages was only 1 mm.ConclusionThe autogenic chondrocytes combining CMACM and FG matrix is a potential material to the cartilage tissue engineering.The volume and thickness of new-formed cartilage tissue is limited and micro-vessles growing into cartilage may contribute to longer survival for new tissues.

Allograft chondrocyte;Cartilage microparticle;Acellular matrix;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2010）01－0005－04

2010年1月4日；

2010年2月10日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.002

國家自然科學基金項目（30672186）。

100191北京市北京大學第三醫院成形外科。

李健寧。