氯化-四(對羧基苯基)錳卟啉催化過亞硝酸根分解及硝化酪氨酸的研究

過亞硝酸根(ONOO-)是生物體的一類內源性細胞毒素，具有強烈的氧化和硝化作用，能夠誘導蛋白質、脂質、DNA等生物大分子的損傷，與心血管疾病、糖尿病、神經退行性疾病、炎癥及癌癥密切相關[1,2]。如何抑制過亞硝酸根毒性一直是此領域的研究熱點。在過亞硝酸根抑制劑的研究中，金屬卟啉類抑制劑因其清除速度快、效率高等優點，受到廣泛關注。

1996年，Stern等[3]首次發現水溶性鐵卟啉能夠有效催化過亞硝酸根的分解，從而抑制過亞硝酸根的毒性，引發了金屬卟啉清除過亞硝酸根的研究熱潮。近年來，各國學者開始研究以金屬卟啉為代表的多種金屬化合物催化過亞硝酸根分解的原理，并積極尋找和合成更多、更好的清除過亞硝酸根的大分子金屬化合物。

作者在此以氯化-四(對羧基苯基)錳卟啉[T(p-COOH)PPMnCl]為對象，研究新型錳卟啉在生理條件下催化過亞硝酸根分解和硝化酪氨酸的反應動力學。對過亞硝酸根毒性抑制劑的研究及過亞硝酸根相關疾病藥物的開發具有積極的意義。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

過亞硝酸根溶液按照1995年Uppu等[4]提出的兩相反應體系過氧化氫與亞硝酸異戊酯的取代反應來制備。每次實驗前用紫外可見分光光度計在302 nm測定過亞硝酸根的吸光度，根據ε302=1670 L·mol-1·cm-1計算過亞硝酸根濃度。

卟啉配體參照文獻[5]合成。金屬卟啉參照文獻[6]合成，收率為90%～95%，合成的錳卟啉結構見圖1。其它試劑均為國產分析純，實驗用水為二次去離子水。

U3010型紫外可見分光光度計，日本日立公司；SFM-300/MOS-250型停留動力學與光譜分析系統、Bio-Kine 32 V4.27動力學曲線模擬軟件，法國比奧羅杰公司。

圖1 錳卟啉結構圖

1.2 方法

1.2.1 生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動力學研究

在過亞硝酸根濃度為400 μmol·L-1、錳卟啉濃度為10 μmol·L-1、生理條件下，利用停留動力學裝置研究錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動力學。在302 nm處測定過亞硝酸根的吸光度[4]，得到錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動力學曲線，表觀速率常數由動力學軟件Bio-Kine擬合計算得出。每組實驗平行進行7次。

在37℃，研究不同濃度的錳卟啉催化過亞硝酸根分解的反應動力學。錳卟啉的濃度分別為0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1，過亞硝酸根濃度為400 μmol·L-1。用動力學軟件Bio-Kine模擬分解曲線得到表觀速率常數。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃測定10 μmol·L-1錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數。通過Arrhenius定理lnk=lnA-(Ea/RT)，求得活化能Ea。

1.2.2 生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的動力學研究

利用紫外可見分光光度法，測定生理條件下不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的生成量，以此考察錳卟啉生理條件下催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的效果。在37℃,將1 mmol·L-1酪氨酸和不同濃度(0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1)錳卟啉溶于pH值7.4的0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液中，37℃水浴，劇烈攪拌，分滴(間隔30 s)加入過亞硝酸根溶液，使過亞硝酸根終濃度為1 mmol·L-1，反應30 min,根據3-NT在480 nm處的吸光度值(ε480=2200 L·mol-1·cm-1)[7]計算3-NT的濃度。

在過亞硝酸根濃度為50 μmol·L-1、酪氨酸濃度為1 mmol·L-1、生理條件下，利用停留動力學裝置研究不同濃度(0 μmol·L-1、2 μmol·L-1、6 μmol·L-1、10 μmol·L-1、14 μmol·L-1)錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的動力學。在418 nm處測定3-NT的吸光度[7]，得到錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的動力學曲線，表觀速率常數由動力學軟件Bio-Kine擬合計算得出。每組實驗平行進行7次。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃測定10 μmol·L-1錳卟啉催化500 μmol·L-1過亞硝酸根硝化1 mmol·L-1酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數。通過Arrhenius定理，求得活化能Ea。

2 結果與討論

2.1 生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動力學研究

利用停留技術研究了37℃生理條件下錳卟啉催化過亞硝酸根分解的反應動力學，動力學衰減曲線如圖2所示。

圖2 生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的動力學曲線

由圖2可見，生理條件下錳卟啉存在時，過亞硝酸根的分解顯著加快。通過動力學軟件，得到37℃下無錳卟啉時(圖1a),過亞硝酸根分解的表觀速率常數kobs為1.34 s-1,根據公式t1/2=ln2/kobs，計算得到過亞硝酸根自發分解的半衰期為0.52 s；有錳卟啉時(圖1b)，表觀速率常數kobs為8.29 s-1，半衰期為0.08 s。與無錳卟啉相比，過亞硝酸根分解反應速率常數增大、半衰期縮短，說明錳卟啉促進了過亞硝酸根的分解。

在37℃生理條件下,不同濃度的錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數如圖3所示。

圖3 37℃下不同濃度錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的表觀速率常數

由圖3可見，在生理條件下,隨著錳卟啉濃度的增加,錳卟啉催化過亞硝酸根分解的表觀速率常數呈線性增大。表觀速率常數kobs=k0+kcat[Catalyst]，其中k0為空白時的表觀速率常數、kcat為催化活性，由直線斜率即可得到錳卟啉的kcat為7.23×105L·mol-1·s-1。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃下，測定錳卟啉催化過亞硝酸根分解的表觀速率常數，繪制過亞硝酸根分解的阿倫尼烏斯曲線，如圖4所示。

圖4 10 μmol·L-1錳卟啉催化400 μmol·L-1過亞硝酸根分解的阿倫尼烏斯曲線

利用阿倫尼烏斯定理，求得錳卟啉催化過亞硝酸根分解的活化能Ea為27.6 kJ·mol-1,而過亞硝酸根自發分解的活化能為80.8 kJ·mol-1。說明錳卟啉使過亞硝酸根分解的活化能降低，加快了過亞硝酸根分解的速率。

2.2 生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的動力學研究

不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的3-NT生成量如圖5所示。

圖5 不同濃度錳卟啉下3-NT的生成量

由圖5可知，3-NT的濃度隨著錳卟啉濃度的增加而增大，當錳卟啉濃度從0增加至14 μmol·L-1時，3-NT的濃度從0.09 μmol·L-1升至0.21 μmol·L-1，增加了133%。可見生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸的能力較大。

在37℃生理條件下，不同濃度錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數如圖6所示。

圖6 37℃下不同濃度錳卟啉催化3-NT生成的表觀速率常數

由圖6可知，在生理條件下，隨著錳卟啉濃度的增加，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數呈線性增大。表觀速率常數kobs=k0+kcat[Catalyst]，由直線斜率即可得到錳卟啉的kcat為5.24×105L·mol-1·s-1。

分別在4℃、15℃、25℃、37℃、45℃，測定錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的表觀速率常數，繪制錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的阿倫尼烏斯曲線，如圖7所示。

圖7 10 μmol·L-1錳卟啉催化500 μmol·L-1過亞硝酸根硝化1 mmol·L-1酪氨酸的阿倫尼烏斯曲線

利用阿倫尼烏斯定理，通過動力學數據求得錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的活化能Ea為40.1 kJ·mol-1;而過亞硝酸根硝化游離酪氨酸的活化能為75.3 kJ·mol-1。說明錳卟啉使過亞硝酸根硝化酪氨酸的活化能降低，加快了過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的速率。

3 結論

利用停留技術和快速反應動力學方法，測定了生理條件下,錳卟啉催化過亞硝酸根分解的催化反應速率常數kcat為7.23×105L·mol-1·s-1，活化能Ea為27.6 kJ·mol-1，與空白實驗比較，活化能顯著降低，說明生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根分解的效果明顯；測定了生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的催化反應速率常數kcat為5.24×105L·mol-1·s-1，活化能Ea為40.1 kJ·mol-1，與空白實驗比較，活化能顯著降低，說明生理條件下，錳卟啉催化過亞硝酸根硝化酪氨酸生成3-NT的效果明顯。

參考文獻：

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