一種喹唑啉酮衍生物與牛血清白蛋白的相互作用

喹唑啉酮類化合物是一類具有藥效的小分子，在醫藥領域具有重要的研究價值。喹唑啉酮類化合物具有多種生理活性，主要表現在對表皮生長因子受體(EGFR)或酪氨酸激酶(EGFR.TK)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子(PDGFR)、神經生長因子受體(NGFR)及其它多個作用靶點的抑制活性，從而發揮抗癌、抗菌、抗病毒等多種藥理作用，引起了人們廣泛的研究興趣。3-(2-羥乙基)-2-對甲苯胺基喹唑啉-4(3-H)-酮(HTQ)作為喹唑啉酮類化合物的一種衍生物可以預見有很好的生物活性[1]，其結構如圖1所示。

圖1 HTQ的結構式

蛋白質是生物體內最重要的一類生物大分子，藥物進入人體后需要通過血漿的儲運才能發生藥理作用，血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白。通過測定血清白蛋白的變化，可為疾病診斷、療效觀察提供有價值的資料及數據。因此，從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質與具有生物活性的小分子間的相互作用，從而了解藥物的作用機制，已成研究熱點。

活性小分子與血清白蛋白相互作用的研究是介于化學與生命科學之間的邊緣性課題，采用的研究方法有熒光法、紫外光譜法和色譜法等，其中熒光法研究藥物活性小分子與蛋白質的結合反應不僅靈敏度高，而且可以綜合利用蛋白質和活性小分子的熒光猝滅、能量轉移和實驗條件的影響等方面的信息，因而是主要的研究手段[2]。作者在此應用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了HTQ與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，包括結合位置、結合常數、作用力類型、共存物質的影響以及藥物在血液中的分配等。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

HTQ由咸寧學院化學與生命科學學院有機合成實驗室提供；BSA溶解在Tris-HCl緩沖溶液中，實驗前15 min配制BSA溶液；Tris(生化試劑)；濃鹽酸；NaCl；所用試劑均為分析純；實驗用水為二次亞沸水。

帶恒溫槽系統的F-4500型熒光分光光度計、UV-2300型可見分光光度計，日本日立公司；BS-120型電子分析天平(d=0.0001)；PHS-3C型數字式酸度計。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

蛋白質溶液的配制：分別稱取0.0355 g BSA溶于Tris-HCl緩沖溶液中,配制50 mL不同溫度(T=298 K、302 K、306 K、310 K)下pH值7.4的1×10-5mol·L-1BSA溶液。

猝滅劑的配制：稱取0.0012 g HTQ溶于2 mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，配制成濃度為2×10-3mol·L-1的HTQ溶液。

在2 cm比色皿中分別加入2 mL 1×10-5mol·L-1的BSA溶液和不同量的2×10-3mol·L-1HTQ溶液，得不同摩爾比的BSA-HTQ系列溶液。

1.2.2 紫外吸收光譜分析

測定摩爾比為1∶1的BSA-HTQ溶液的紫外吸收光譜。

1.2.3 熒光光譜分析

測定各溶液在不同溫度下的熒光光譜。激發和發射狹縫均為2.5 nm,以λex=295 nm激發,在300～500 nm波長范圍內掃描并繪制不同濃度HTQ溶液對BSA的熒光猝滅光譜。分別固定Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm掃描其同步熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 HTQ對BSA的熒光猝滅

HTQ作為熒光猝滅劑，在與BSA結合的過程中，能不同程度地猝滅BSA的熒光強度。固定BSA濃度為1×10-5mol·L-1，向其中分次(每次2 μL，共7次)加入2×10-3mol·L-1的HTQ溶液，測定各次BSA的熒光光譜，結果見圖2。

a～h.HTQ用量(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14

由圖2可以看出，隨著HTQ濃度的增大，BSA的熒光強度有規律地降低。由于HTQ分子本身在λ=367 nm附近沒有熒光峰，故HTQ不會發生與BSA相互干擾的熒光，因此，HTQ對BSA的熒光有猝滅作用。

2.2 猝滅機理的推斷

熒光被猝滅的原因有三種：動態猝滅、靜態猝滅和非輻射能量轉移。熒光猝滅過程通常可以分為動態猝滅和靜態猝滅。動態猝滅是猝滅劑和熒光物質的激發態分子發生作用導致熒光猝滅的過程,其過程遵循Stern-Volmer方程[3]：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中：F0、F分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質的熒光強度；KSV為Stern-Volmer動態猝滅常數；Kq為雙分子猝滅過程速率常數；τ0為猝滅劑不存在時熒光分子平均壽命(生物大分子熒光壽命約為1×10-8s )[4]；[Q]為猝滅劑(HTQ)濃度，mol·μL-1。通常各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態猝滅速率常數為2.0×1010L·mol-1·s-1(Kq≤2.0×1010L·mol-1·s-1)[5]。

靜態猝滅是猝滅劑和熒光物質分子的基態分子發生作用導致熒光猝滅的過程，靜態猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數函數關系來描述:

(2)

式中：KLB為基態配合物的生成常數。

一般情況下，動態和靜態猝滅可依據不同溫度條件下的結果得以區別。對于動態猝滅，溫度的升高將增加分子間的有效碰撞和加劇能量轉移過程，導致動態熒光猝滅常數KSV增大。對于靜態猝滅，溫度的升高將降低藥物與蛋白所形成復合物的穩定性，導致猝滅常數減小[6]。

分別研究了在298 K、302 K、306 K、310 K時，加入HTQ后BSA熒光強度的變化，并繪制BSA的Stern-Volmer曲線，結果見圖3。

圖3 不同溫度下(F0/F)-1～[Q]關系

由圖3可知，隨著溫度的升高，KSV增大。

由線性方程求得猝滅常數KSV和相關系數，根據KSV=Kqτ0計算得到4個溫度下的猝滅速率常數Kq均小于2.0×1010L·mol-1·s-1。表明HTQ對BSA的猝滅是由于分子間碰撞而引起的動態猝滅。

表1 HTQ對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程 以及相關的KSV

2.3 作用力類型的分析

活性小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵力、靜電引力、范德華力、疏水作用力等。不同分子與蛋白質的結合力類型是不同的。Ross等根據大量的實驗結果，總結出判斷生物大分子與有機小分子等結合力性質與結合作用熱力學函數之間關系的規律，根據反應前后熱力學焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷藥物與蛋白質之間的主要作用力類型：ΔH>0、ΔS>0為疏水作用力；ΔH<0、ΔS<0為氫鍵力和范德華力；ΔH≈0、ΔS>0為靜電引力[7]。假設在測定溫度范圍內焓變變化不大，則它的值和熵變ΔS可以從Van′t Hoff 方程求得:

lnK=-ΔH/(RT)+ΔS/R

(3)

這里的K值近似于相應溫度下Stern-Volmer方程中的猝滅常數KSV,通過lnKSV對1/T作圖(圖4),直接算出ΔHθ和ΔSθ，再由ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ可計算出ΔGθ，相關數據列于表2。

pH=7.4,c(BSA)=1×10-5 mol·L-1

表2 Stern-Volmer 動態猝滅常數KSV及相關熱力學參數(pH=7.4)

由表2可知,該反應是自發的(ΔG<0)，HTQ對BSA的作用力主要為疏水作用力(ΔH>0、ΔS>0)。

2.4 HTQ與BSA的結合位點數和結合常數

對于動態猝滅過程,熒光強度與猝滅劑的關系可由熒光分子和猝滅劑分子之間的結合常數表達式推導求出[8]。設BSA有n個獨立的結合位點,則其與HTQ間的猝滅反應可表示為BSA+n[Q]=BSA[Q]n，其表觀結合常數Kb=[BSA[Q]n]/[BSA][Q]n。若熒光體總濃度為[BSA]0,則[BSA]0=[BSA[Q]n]+[BSA],當[Q]?[BSA]0時,猝滅劑的起始濃度代替其平衡濃度,則Kb=([BSA]0-[BSA])/[BSA][Q]n。

動態猝滅中,體系的熒光強度F與其游離熒光體濃度成正比,將[BSA]/[BSA]0=F/F0代入上式得：

lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[Q]

(4)

式中：n為結合位點數；Kb為表觀結合常數。繪制lg[(F0/F) - 1]～lg[Q]直線，斜率就是結合位點數n、截距就是lgKb。相關數據列于表3。

由表3可知，在接近人的生理溫度(310 K)時，結合位點n接近1，說明HTQ與BSA易以1∶1形成復合物，且溫度對HTQ與BSA的結合常數Kb影響較小(Kb值均在2.228×10-2～3.356×10-2L·mol-1之間),Kb平均值為2.846×10-2L·mol-1。說明HTQ與BSA之間有較強的結合作用，可以被蛋白質所儲存和運輸。

表3 不同溫度下的表觀結合常數Kb和結合位點數n

2.5 HTQ與BSA的能量轉移機制以及結合距離

能量轉移作用可以發生在藥物蛋白質復合物內部,也可以發生在藥物與蛋白質分子之間。在后一種情況時，利用F?rster能量轉移理論,可以求出和蛋白質作用的藥物與色氨酸殘基之間的距離,由此推測藥物與蛋白質結合的空間部位。

按F?rster的偶極-偶極非輻射能量轉移理論[9]，可求得化合物HTQ結合時結合位置與蛋白質分子中熒光發射基團之間的距離:

(5)

式中：E為能量轉移效率；r為給體(BSA)和受體(HTQ)的距離；R0為轉移效率為50%時的臨界距離，可由下式求出:

(6)

式中:K2為偶極空間取向因子;n為介質的折射指數;Ф為給體的熒光量子產率;J為給體的熒光發射光譜與受體吸收光譜的光譜重疊積分，即：

(7)

式中:F(λ)為熒光給體在波長λ處的熒光強度;ε(λ)為受體在波長λ處的摩爾吸光系數。

圖5為BSA與HTQ的摩爾比為1∶1時，HTQ的吸收光譜與BSA熒光發射光譜的重疊圖。

圖5 BSA的熒光發射光譜(a)和HTQ的吸收光譜(b)

將圖5的光譜重疊部分按式(7)求出J。在上述實驗條件下，取K2=2/3、n=1.36、Ф=0.15，代入式(6)可求出R0=2.69 nm；通過式(5)求出能量轉移效率E=0.84。根據R0、E的值，由式(5)算出BSA內色氨酸殘基與HTQ的距離r=2.04 nm,符合能量轉移理論,說明BSA與HTQ是足夠靠近(r<8 nm),其結合是通過非輻射能量轉移而促使蛋白質的熒光猝滅。

2.6 HTQ對BSA構象的影響

同步熒光光譜已經被應用于蛋白質構象的分析。由Δλ=15 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質中酪氨酸殘基的熒光，由Δλ=60 nm所得的同步熒光只顯示蛋白質中色氨酸殘基的熒光，因殘基的最大發射波長與其所處環境的極性有關，故由發射波長的改變可以判斷蛋白質構象的變化[10]。

固定BSA的濃度，逐漸增大(每次2 μL)HTQ的濃度，記錄Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時的同步熒光光譜，結果見圖6。

pH=7.4;c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1，a～i(μL)：0,2,4,6,8,10,12,14,16

圖6中的最大峰為蛋白質的熒光峰，可見色氨酸殘基的最大發射波長基本不變，酪氨酸殘基的最大發射波長紅移(圖6兩直線所示)。表明HTQ的加入使BSA的構象發生了變化,酪氨酸殘基所處環境的疏水性降低,BSA內部的疏水結構有所瓦解。

BSA及BSA-HTQ體系的三維熒光光譜見圖7、強度等高線圖見圖8。

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1;T=310 K

c(BSA)=1×10-5 mol·L-1;c(HTQ)=2×10-3 mol·L-1

比較BSA及BSA-HTQ的三維熒光光譜特征,從峰的類別看:圖7中的兩條逐漸升高的“山脊”形峰分別對應于圖8中的兩條“鉛筆”形紋線，它們的共同特征是λex=λem(Δλ=0)，是瑞利散射線；圖7中λem=295 nm左右的兩個“駝峰”形寬峰分別對應于圖8中瑞利散射線右下方的“指紋”線,λem基本保持不變，這都是熒光峰的典型特征。從峰的位置看:加入HTQ后，BSA的瑞利散射峰起始位置及熒光峰位置均無明顯變化。從峰的強度看:加入HTQ后,瑞利散射峰的強度和熒光峰的相對強度均有不同程度的降低。BSA的空間結構由3個結構域組成，每個結構域由2個亞結構域以槽口相對的方式形成圓筒狀結構，幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內部，構成疏水腔，HTQ分子的結合部位可能都處于這種疏水腔中，正是HTQ分子的加入導致了這種疏水微環境極性的改變，進而導致了BSA構象的變化[11]。

3 結論

應用熒光光譜法、紫外吸收光譜法研究了HTQ與BSA 的相互作用。結果表明，HTQ對BSA的熒光猝滅機理是動態猝滅過程,表觀結合常數Kb為2.846×10-2L·mol-1、結合位點數接近于1，HTQ與BSA以摩爾比1∶1結合,其結合反應主要是熵驅動,反應中主要作用力是疏水作用力。BSA內色氨酸殘基與化合物HTQ分子間的距離r=2.04 nm，加入HTQ后BSA的構象發生了變化。

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