銅綠假單胞菌對映選擇性降解制備R-扁桃酸

R-扁桃酸是制備多種手性藥物的重要中間體，如用于半合成青霉素和頭孢菌素等抗生素、血管擴張劑、殺菌劑、鎮痙劑、減肥藥物、抗腫瘤藥物等的合成[1,2]。R-扁桃酸的國際市場需求逐年增長，市場潛力巨大[3]，加快R-扁桃酸的研究開發具有重要的意義。

目前，制備R-扁桃酸的方法有化學不對稱合成法、化學拆分法、色譜拆分法和生物制備法,其中，生物制備法包括：動力學拆分法[4]、不對稱轉化法[5,6]、去消旋作用[7～10]、雙酶轉化[11]、微生物和酶耦合反應[12]、雙微生物發酵[13]等。微生物去消旋作用制備手性扁桃酸理論產率達50%，已有報道Brevibacteriumsp.[8]、Alcaligenessp.[9]和Pseudomonassp.[7,10]等微生物可選擇性降解制備R-或S-扁桃酸。

作者在此以外消旋扁桃酸為唯一碳源篩選得到一株能夠高效選擇性降解S-扁桃酸制備R-扁桃酸的新型菌株銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，并對該菌發酵制備R-扁桃酸的條件進行了優化研究。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

外消旋扁桃酸、苯乙酮酸，國藥集團化學試劑公司；其余試劑均為國產色譜純或分析純。

UV-1800型分光光度計，日本Hitachi;LC-10VP型高效液相色譜儀，日本島津；WXG-4型旋光儀。

1.2 培養基

富集培養基(g·L-1)：外消旋扁桃酸 4，酵母浸粉 1，NH4Cl 1.6，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5， pH值7.0。

篩選培養基(g·L-1)：酵母浸粉 1.5，NH4Cl 0.8，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，外消旋扁桃酸 5，pH值7.0。

基礎培養基(g·L-1)：扁桃酸 5，酵母浸粉 5，NH4Cl 1.6，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，MnSO40.05，pH值7.0。

發酵培養基(g·L-1)：甘油 1，蛋白胨 3.5，酵母浸粉 3.5，NH4Cl 4，K2HPO41，KH2PO41，NaCl 1，MgSO40.5，ZnSO40.4，pH值7.5。

1.3 方法

1.3.1 篩選

富集：各取1.5 g采自校園周圍的10個土樣置于以外消旋扁桃酸為唯一碳源的富集培養基中，于37℃、150 r·min-1富集培養48 h。

初篩：將富集培養液以2%的接種量，重新轉接于篩選培養基中培養48 h，將培養液進行系列稀釋涂布平板。在各個平板上挑出具有不同形態的單菌落于斜面培養基純化。

復篩：挑取純化后的菌株接入篩選培養基中，于37℃、150 r·min-1搖床培養，定時取培養液，進行色譜檢測，分析菌株對扁桃酸的代謝情況。

1.3.2 培養

挑取篩選得到的菌種接種至基礎培養基中，在35℃、160 r·min-1的恒溫搖床培養12 h，以6%的接種量將培養液接種到裝液量50 mL/250 mL搖瓶的發酵培養基中，在35℃、160 r·min-1的恒溫搖床上培養，定期取樣檢測。

1.3.3 分析檢測

細胞生物量采用分光光度計通過濁度OD600測定。

扁桃酸、苯甲酰甲酸和苯甲酸的濃度采用高效液相色譜測定。色譜條件：色譜柱Agilent，RP-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶磷酸緩沖溶液(6.6 g·L-1Na2HPO4，6.8 g·L-1KH2PO4)=1∶9(體積比)，流速1 mL·min-1，室溫，檢測波長210 nm。

參照文獻[14,15]用旋光儀檢測樣品的旋光度，并計算光學純度(OP)。

2 結果與討論

2.1 菌種篩選

篩選得到12株可代謝扁桃酸菌株，其中4株可選擇性降解S-扁桃酸，49#菌活性最高，產物R-扁桃酸光學純度達到98%。該菌經16S rDNA鑒定為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。

2.2 發酵培養液的HPLC分析結果

以底物濃度為131.4 mmol·L-1的發酵培養基搖瓶發酵36 h，取發酵液樣品進行HPLC分析，結果見圖1，扁桃酸的代謝曲線見圖2。

圖1 發酵36 h時的代謝產物

由圖1可知，發酵液中主要含有扁桃酸(4.515 min)、苯乙酮酸(7.998 min)和苯甲酸(6.748 min)。因此，可推測此代謝途徑可能是S-扁桃酸經脫氫酶氧化為苯乙酮酸，再經脫羧、氧化成為苯甲酸，最后被逐步完全降解。這與Shimao等[16]報道的Pseudomonasputida代謝扁桃酸的途徑相似。

圖2 扁桃酸代謝曲線

從圖2可以看出，以131.4 mmol·L-1底物濃度進行搖瓶發酵時，隨著反應的進行，扁桃酸的濃度迅速下降,48 h時降解50%后，扁桃酸濃度不再繼續下降，并基本保持不變，經測定殘留扁桃酸為R-扁桃酸且光學純度為99%。代謝過程中兩個中間代謝產物的濃度都隨著扁桃酸濃度的變化而變化，苯乙酮酸和苯甲酸達到最大濃度的時間分別是26 h和34 h，48 h時S-扁桃酸被完全降解。

2.3 R-扁桃酸轉化方法的比較

采用三種轉化方式(底物終濃度65.7 mmol·L-1)對P.aeruginosa降解S-扁桃酸制備R-扁桃酸進行了研究。(1)全細胞轉化法。發酵培養基培養菌體24 h后，收集菌體并重懸于同體積轉化液中搖床轉化；(2)直接發酵法。發酵培養基添加底物直接進行發酵培養；(3)添加底物發酵法。發酵培養基培養菌體24 h后，添加底物進行發酵。結果發現，三種方法完成轉化的時間分別為88 h、60 h和72 h。采用直接培養發酵法制備R-扁桃酸效率最高，且操作方便。

2.4 培養基成分優化

對P.aeruginosa發酵法制備R-扁桃酸的發酵培養基中碳源、氮源、金屬離子等進行優化實驗。結果發現：氮源中，有機氮優于無機氮，但有機氮使菌體代謝產生大量堿性物質，適量的無機氮可緩解此問題，選擇氮源的種類和用量為蛋白胨 3.5 g·L-1、酵母浸粉3.5 g·L-1、NH4Cl 4 g·L-1；金屬離子中，Mg2+和Zn2+對培養轉化有促進作用，其它金屬離子影響不明顯，選擇Mg2+和Zn2+的用量分別為0.5 g·L-1和0.4 g·L-1；碳源中，葡萄糖和甘油均可顯著提高菌體生物量，但葡萄糖嚴重抑制扁桃酸的代謝，而甘油在濃度較低時，菌體量大且苯甲酸積累少，有利于發酵，在濃度高于5 g·L-1時，則使得苯甲酸大量積累且代謝十分緩慢，選擇碳源為1 g·L-1甘油。

2.5 溫度對S-扁桃酸降解的影響(圖3)

圖3 溫度對P.aeruginosa的生長和代謝活性的影響

由圖3可以看出，在25～37℃的條件下，隨著溫度的升高，P.aeruginosa菌株代謝相對活性(基于37℃時最高代謝活力為1計算)逐漸增大;當溫度為37℃時，相對活性達到最大值；溫度高于37℃時，活性迅速下降；45℃時細胞活性幾乎完全喪失。鑒于P.aeruginosa在培養溫度為35℃時菌體生長最佳、生物量(OD600)最高，而37℃與35℃時S-扁桃酸代謝活性相差很小，選擇最適培養轉化溫度為35℃。

2.6 pH值對S-扁桃酸降解的影響

由于P.aeruginosa適合在中性和微堿環境中生長。在pH值5.0以下和pH值11.0以上環境中不能生長；在pH值6.0～10.0范圍內生長，且在pH值7.0～9.0時生長較好，生物量高。因此，研究pH值在6.0～10.0范圍內對65.8 mmol·L-1外消旋扁桃酸降解的影響，結果見圖4。

圖4 pH值對S-扁桃酸降解的影響

由圖4可以看出，隨著pH值的增大，S-扁桃酸降解速度逐漸減慢。pH值為6.0～7.0時，36 hS-扁桃酸降解完全(OP>99%)；pH值為7.5～8.5時，40～48 hS-扁桃酸降解完全(OP>99%)；而pH值為9.0～10.0時，S-扁桃酸降解速度緩慢，不能完全降解(OP<73%)。

由于苯甲酸是代謝過程中的限速步驟，最終以其降解完全確定培養轉化的完成時間，隨著pH值的增大，苯甲酸的最大積累量減少，轉化完成時間縮短。pH值低(pH值6.0～7.0)時，菌體降解S-扁桃酸的活性強，大量生成中間代謝產物苯甲酸，可能高濃度的苯甲酸抑制菌體對苯甲酸的進一步降解，苯甲酸降解緩慢，需要近70 h才能降解完全，從而致使S-扁桃酸的整個代謝過程時間較長；pH值呈微堿性(pH值7.5～8.5)時，菌體降解S-扁桃酸活性相對較弱，苯甲酸慢慢增加，在低濃度苯甲酸環境中，菌體降解苯甲酸的活性較高，苯甲酸54 h內就被降解完全。因此，pH值對P.aeruginosa降解S-扁桃酸影響較大，最適pH值為8.0。

2.7 底物濃度對S-扁桃酸降解的影響(圖5)

圖5 底物濃度對發酵完成時間及光學純度的影響

由圖5可知，隨著底物濃度的增加，發酵完成時間延長；當底物濃度低于131.4 mmol·L-1時，與發酵完成時間呈很好的線性關系(R2=0.9906)；當底物濃度為131.4 mol·L-1時，68 h即完成發酵，光學純度達到99.2%(R-扁桃酸收率48.2%);而底物濃度高于131.4 mmol·L-1時，不僅完成發酵時間延長，而且光學純度也有所降低。這可能是由于底物濃度高于131.4 mmol·L-1時,存在底物或中間產物抑制。

3 結論

以外消旋扁桃酸作為唯一碳源篩選得到一株高效對映選擇性降解S-扁桃酸的銅綠假單胞菌菌株。在溫度為35℃、pH值為8.0、接種量為6%、轉速為160 r·min-1、底物濃度為131.4 mmol·L-1的條件下，68 h完成發酵，R-扁桃酸收率為48.2%、光學純度為99.2%。該菌活性、底物耐受性及對映選擇性較高，S-扁桃酸及其代謝物被完全降解，簡化了產物分離提取步驟，而且消旋體扁桃酸價格低廉，因此利用微生物選擇性降解消旋體制備高附加值的光學純扁桃酸具有很好的工業化前景。

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