一種酰基高絲氨酸內酯酶篩選方法的建立

許多細菌都能夠合成并釋放一種或多種被稱為自誘導物的信號分子，胞外的信號分子濃度能隨細菌菌體密度的增大而增大，細菌利用信號分子在細胞間的擴散，來感知自身和周圍環境中其它細菌的數量變化[1]。當信號分子達到一定臨界濃度時，就會啟動菌體中相關基因的表達，調控菌體的某些生物行為，如生物膜的形成[2]、孢子的生成、熒光的產生、抗生素的生物合成、毒性因子的產生、胞外多糖的合成、細菌叢集、質粒結合轉移、穩定生長期的進入等，以適應環境的變化，這種現象被稱為群體感應(Quorum sensing，QS)[3]。

近年來，人們逐漸從一些原核生物以及真核生物中鑒定出了一些酰基高絲氨酸內酯酶，能夠降解細菌的群體感應信號分子，干擾細菌的群體感應系統，并且破壞其參與調控的生物學功能[4]。更為重要的是，酰基高絲氨酸內酯酶能夠降解特定的決定動植物病原菌致病因子產生的群體感應信號分子，減輕或者消除病原菌的致病性。許多能夠合成酰基高絲氨酸內酯酶的細菌(如熒光假單胞菌、蘇云金芽孢桿菌[5]等)或攜帶外源酰基高絲氨酸內酯酶基因的工程菌與致病菌歐文氏胡蘿卜軟腐病菌混合后接種馬鈴薯，其發病程度遠遠弱于單獨接種病原菌[6]。這表明，群體感應淬滅機制很可能會成為一種新的生防方法。因此，有必要建立一種酰基高絲氨酸內酯酶篩選方法，以滿足科研和生產的需求。

1 實驗

1.1 菌株、質粒與試劑

紫色色桿菌突變株CV026(Chromobacteriumviolaceum026)報告菌由上海交通大學許煜泉教授、華東理工大學阿華生物工程研究所張元興教授惠贈，LB培養基，Kan抗性，培養溫度為28℃。該報告菌可以指示3OC6-HSL信號分子的存在并產生紫色色素。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)購自天根生化科技(北京)有限公司，LB培養基，培養溫度為37℃。

信號分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)為本實驗室構建，其表達產物AiiA蛋白可以降解3OC6-HSL信號分子，LB培養基，Kan抗性，培養溫度為37℃。

pLuxRI2質粒為美國加州理工學院Frances H.Arnold教授惠贈。

rTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、XhoⅠ限制性內切酶、EcoRⅠ限制性內切酶、DNA marker，Takara公司；LB培養基，上海捷瑞生物工程有限公司；質粒小提中量試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司;其它試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。DNA引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，測序由上海美季生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1luxI基因的PCR擴增

以pLuxRI2質粒為模板，根據3OC6-HSL信號分子合成酶基因luxI序列設計正向引物luxIFP：GTCGGGAATTCCCGAATAAACGCAAGGGAGGTTGG；反向引物luxIRP：AAGTAATCTCGAGGAAGCT-TAACAACATTAATTTAAGACTGC。下劃線部分GAATTC為EcoRⅠ酶切位點、CTCGAG為XhoⅠ酶切位點。luxI基因PCR擴增的反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環;72℃延伸10 min。luxI基因PCR擴增的反應體系：ddH2O 37.75 μL，10×Buffer(Mg2+)5 μL，dNTP 4 μL，正向引物luxIFP 1 μL，反向引物luxIRP 1 μL，pLuxRI2模板1 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，總體系50 μL。

1.2.2luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的構建

根據luxI基因及pET-28a(+)質粒含有的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點，做luxI基因和pET-28a(+)質粒的雙酶切。雙酶切反應條件：37℃水浴2 h。雙酶切反應體系：ddH2O 32 μL，10×Buffer 8 μL，luxI基因或pET-28a(+)質粒32 μL，EcoRⅠ 4 μL，XhoⅠ 4 μL，總體系80 μL。將雙酶切后的luxI基因和pET-28a(+)質粒按10∶1(用量分別為0.3×10-12mol·L-1和0.03×10-12mol·L-1)的比例連接。連接反應條件：16℃連接過夜。連接反應體系：ddH2O 12.5 μL，luxI基因6 μL，pET-28a(+)質粒3 μL，Buffer 2.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，總體系25 μL。將連接液轉化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞中，菌落PCR鑒定后挑取陽性克隆送樣測序。

1.2.3 3OC6-HSL信號分子的合成

將信號分子合成酶表達菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的過夜培養物按1%接種量接種于TSB液體培養基中，Kan抗性，抗生素工作濃度為50 μg·mL-1，搖床轉速為200 r·min-1，37℃培養2～3 h至OD600=0.6，添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，28℃培養6 h。取紫色色桿菌突變株CV026過夜培養物與誘導后的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)各200 μL，混合后置于28℃搖床培養16 h，搖床轉速為150 r·min-1。觀察終培養物顏色，確定3OC6-HSL信號分子合成成功。

1.2.4 篩選體系的建立

LB液體培養基，代替實際篩選體系中用到的信號分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的部分。將20 μL LB液體培養基和100 μL產生有3OC6-HSL信號分子的培養液混合后培養90 min，再與50 μL紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養物混合，過夜培養后觀察終培養物顏色。

1.2.5 篩選體系的優化

將20 μL LB液體培養基分別和誘導了4 h、6 h、8 h的產生有3OC6-HSL信號分子的培養液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL混合后培養90 min，經紫外滅活60 min后，分別與紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養物20 μL、40 μL、60 μL混合，過夜培養后觀察終培養物顏色。篩選體系A～L的組成見表1。

表1 篩選體系(A～L)的組成/μL

1.2.6 酰基高絲氨酸內酯酶的篩選

利用建立的酰基高絲氨酸內酯酶篩選體系，對信號分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的活性進行驗證。將信號分子降解菌aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)的過夜培養物按1%接種量接種于LB液體培養基中，Kan抗性，抗生素工作濃度為50 μg·mL-1，搖床轉速為200 r·min-1，37℃培養2～3 h至OD600=0.6，添加終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，28℃培養6 h。將20 μL誘導后的aiiA/pET-28a(+)/BL21(DE3)分別稀釋1倍、2倍后再與50 μL產生有3OC6-HSL信號分子的培養液混合后培養90 min，經紫外滅活后，與20 μL紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養物混合，過夜培養后觀察終培養物顏色。

2 結果與討論

2.1 luxI基因的PCR擴增(圖1)

M.DL2000 DNA Marker 1.luxI的PCR產物

由圖1可以看出，luxI基因的PCR產物條帶單一無拖尾，且小于750 bp，與預期的621 bp相符，純化后用于質粒構建。

2.2 luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)的構建

對luxI基因和pET-28a(+)質粒進行酶切、連接。連接產物轉化至BL21(DE3)大腸桿菌感受態細胞中，挑取5個克隆做菌落PCR鑒定。選擇其中一個陽性克隆送樣測序。測序結果(圖2)和luxI基因的標準序列完全一致，表明luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)克隆構建成功。將序列正確的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)甘油菌保存于-80℃冰箱中。

圖2 luxI/pET-28a(+)質粒測序結果

2.3 3OC6-HSL信號分子的合成(圖3)

C.對照組 T.實驗組

由圖3可以看出，對照組信號分子合成酶表達菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)未經IPTG誘導，不產生信號分子合成酶，最終無法合成信號分子，CV026報告菌不能產生紫色色素;實驗組luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)經IPTG誘導后產生信號分子合成酶LuxI，進而合成3OC6-HSL信號分子，CV026報告菌在信號分子的存在下產生紫色色素，即終培養物顯示為紫色，證明3OC6-HSL信號分子合成成功。

2.4 篩選體系的建立

LB液體培養基和產生有3OC6-HSL信號分子的培養液混合后培養，由于體系中不含酰基高絲氨酸內酯酶，因此有3OC6-HSL信號分子存在，與紫色色桿菌突變株CV026的過夜培養物混合后培養，CV026在信號分子存在的情況下產生紫色色素，即終培養物顯示為紫色(圖4)。若體系中含有酰基高絲氨酸內酯酶存在，則終培養物紫色變淺或消失。由此可以證明該篩選體系建立成功，可以對酰基高絲氨酸內酯酶進行篩選。

圖4 篩選體系的建立

2.5 篩選體系的優化(圖5)

A～L 各篩選體系從上至下分別為誘導了4 h、6 h、8 h的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)信號分子合成酶表達菌

由圖5可以看出，箭頭所指的體系為最佳篩選體系，即50 μL誘導了6 h的luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)信號分子合成酶表達菌與20 μL不含酰基高絲氨酸內酯酶的LB培養基混合后，再與20 μL的CV026報告菌混合并過夜培養，其終培養物所顯示出的紫色顏色最深。在有酰基高絲氨酸內酯酶存在的情況下，紫色會變淺或消失。

2.6 酰基高絲氨酸內酯酶的篩選(圖6)

1.沒有稀釋的信號分子降解菌 2.稀釋1倍的信號分子降解菌 3.稀釋2倍的信號分子降解菌 C1、C2.不含信號分子降解菌

由圖6可以看出，加入的信號分子降解菌的菌量不同，酰基高絲氨酸內酯酶的酶量也不同。由于信號分子被部分或全部降解，CV026報告菌在少量信號分子或沒有信號分子存在下產生很淺的紫色色素或者完全沒有紫色色素產生。由此可見，該篩選體系可以對酰基高絲氨酸內酯酶進行有效的篩選，并對不同酶活性的酰基高絲氨酸內酯酶具有很好的區分度。

2.7 討論

(1)信號分子3OC6-HSL價格昂貴且易降解。本研究通過構建信號分子合成酶表達菌luxI/pET-28a(+)/BL21(DE3)，對其進行誘導表達合成3OC6-HSL信號分子，降低了實驗成本，很好地解決了這一難題。

(2)菌種篩選過程工作量大，篩選結果存在一定的偶然性，方法得當可以大大縮短篩選的周期，盡快獲得實驗結果。菌種篩選中可以用離心管代替搖瓶，如果有條件保證無菌操作，也可以采用96孔板，既節省了培養基，又縮短了操作時間，加快了實驗進度。

3 結論

建立了一種酰基高絲氨酸內酯酶篩選方法，并對篩選體系進行優化。最終確定信號分子合成酶的誘導時間為6 h、含有信號分子的培養液的體積為50 μL、CV026報告菌的過夜培養物的體積為20 μL。該方法可用于酰基高絲氨酸內酯酶的篩選，并且對不同酶活性的酰基高絲氨酸內酯酶具有很好的區分度。

參考文獻：

[1] Fuqua W C,Winans S C,Greenberg E P.Quorum sensing in bacteria:The LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators[J].J Bacteriol,1994，176(2):269-275.

[2] Hastings J W,Greenberg E P.Quorum sensing:The explanation of a curious phenomenon reveals a common characteristic of bacteria[J].J Bacteriol,1999，181(9):2667-2668.

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