菊苣種質資源遺傳多樣性的SRAP研究

羅燕，白史且，彭燕，張玉，馬嘯

（1.四川省草原科學研究院 四川 成都611731；2.四川農業大學草業科學系 四川 雅安625014）

菊苣（Cichoriumintybus）為多年生草本植物，是一種高產優質的飼用牧草，原產于地中海、中亞和北非。菊苣在大洋洲的新西蘭、澳大利亞和歐洲法國、意大利以及北美洲的美國等地亦為重要的牧草資源［1］。可將菊苣和糧食作物進行間種，可解決牧草種植與糧食作物爭地問題，促進種植業結構向多元化發展［2］。在我國，菊苣主要分布于北京（百花山）、黑龍江（饒河）、遼寧（大連）、山西、陜西、新疆（烏魯木齊、伊寧、阿勒泰）等地，生于濱海荒地、河邊、水溝邊或山坡。

目前，我國已經登記了2個菊苣品種，皆為引進品種。從總體而言，菊苣資源的研究相對于其他牧草和作物也還有一定的差距，一些珍貴的優良生態型以及居群分布正在縮小，菊苣基因資源還在丟失，資源研究的深度和資源收集的廣度不夠，可以供篩選的優秀種質缺乏，嚴重影響了菊苣品種的選育。當前，圍繞菊苣遺傳多樣性的研究已經有相關報道，Van Cutsem等［3］采用AFLP標記對菊苣野生種和栽培種之間的基因流動進行了研究；Baes和 Van Cutsem［4，5］用同工酶，Kiers等［6］及 Koch和Jung［7］用 RAPD和 AFLP標記證明菊苣栽培種中存在豐富的遺傳多樣性；Baes和Van Cutsem［5］研究了栽培野生種、商業品種和布魯塞爾菊苣3個基因庫的10種同工酶的多態性。目前，對菊苣種質資源進行SRAP分子標記的研究尚未見報道。

DNA是生物的遺傳物質，DNA的多態性是生物多樣性的本質內容。目前，國內外許多學者都已經利用DNA分子標記技術在草坪草及牧草上進行了各種研究［8－10］。相關序列擴增多態性（sequence－related amplified polymorphism，簡稱SRAP）［11］，是由 Li和 Quiros［12］在2001年創建的一種 DNA 分子標記技術，具有簡便、穩定、產率高、便于克隆目標片段的特點［13］，它克服了 RAPD（random amplified polymorphic DNA）重復性差、SSR（simple sequence repeats）位點較少、AFLP（amplified fragment length polymorphism）成本高的缺點，其重復性和穩定性好，已被應用于圖譜構建、比較基因組學和遺傳多樣性分析，是當前檢測種質資源遺傳多樣性、構建高密度連鎖圖譜、定位克隆基因、品種鑒定等的有力工具。SRAP在草業科學領域中的研究不多，Budak等［13］利用34對SRAP引物組合分析了53份野牛草（Buchlo?dactyloides）基因型之間的遺傳多樣性及表型關系。陳宣等［14］對結縷草屬（Zoysia）植物耐鹽性SRAP分子標記進行了研究。季楊等［15］對多花黑麥草品種（系）（Loliummultiflorum）間雜交及其雜種后代進行SRAP遺傳分析。薛丹丹等［16］對通過SRAP分子標記技術對結縷草屬植物種間雜交的5個組合37份雜交后代進行了真假雜種的鑒定。

本研究采用SRAP分子標記技術對48份菊苣材料的基因組DNA進行了多態性擴增，旨在從分子水平對不同類群菊苣資源進行遺傳多樣性分析，為綜合評價菊苣種質資源，篩選菊苣優良種質和新品種選育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菊苣種質材料從國內外收集而來，總計48份。其中13份來自意大利，10份來自荷蘭，10份來自法國，3份來自匈牙利，2份來自德國，2份來自波蘭，2份來自瑞士，1份來自葡萄牙，5份來自四川省草原科學研究院（表1）。

表1 供試菊苣的資源編號及來源Table 1 Accesion code and sources of C.intybus used in this study

1.2 基因組DNA提取

2008年3月隨機選取不同材料的菊苣健康幼葉，采用Plant Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）進行DNA提取。通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，合格的DNA樣品于－20℃冰箱內保存備用。

1.3 SRAP－PCR反應

參照Li等發表的引物［9］，設計了8條上游引物和11條下游引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成（表2）。SRAP－PCR反應采用的是復性變溫法：循環包括94℃變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，共5個循環；之后35個循環：94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min；4℃保存。

擴增反應總體系為20μL：模板DNA 4μL（60 ng／μL），10×PCR Buffer 2μL，Mg2＋2μL（25 mmol／L），d NTP 1.6μL（2.5 mmol／L），Tag酶0.4μL（2.5 U／μL），上、下游引物均為0.2μL（10μmol／μL），滅菌水5.2 μL，礦物油覆蓋。

表2 用于菊苣SRAP分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in SRAP analyses of C.intybus

1.4 擴增產物的分離和檢測

DNA擴增產物在0.5×TBE緩沖系統中，用含有溴化乙錠（EB）的1.5%瓊脂糖電泳分離，同時以DL 2000 Markers（北京天根生化科技有限公司）作為分子量標記。恒壓120 V，時間150 min，使用BIO－RAD自動凝膠成像系統觀察并照相。

1.5 數據統計及分析

對擴增產物按條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，構成遺傳相似矩陣。據表征矩陣，統計SRAP擴增產物的條帶總數和多態性條帶數量，計算多態性位點率（P）和引物多態性信息含量（PIC）［17］，PICi＝2fi（1－fi），其中，PICi表示引物“i”的多態性信息含量，“fi”表示有帶所占的頻率，“1－fi”表示無帶所占的頻率。利用NTSYS－PC 2.10軟件計算Dice遺傳相似性系數（GS），根據UPGMA法［18］進行聚類分系以及采用EIGEN方法進行主成分分析（PCo A）。

2 結果與分析

2.1 供試材料SRAP擴增產物的多態性分析

通過8條上游引物和11條下游引物的篩選（表3），選定28對（組）可產生多態性且重復性好的引物對5個地理類群48個個體的基因組DNA進行SRAP擴增，共得到333條清晰可辨條帶。其中，多態性條帶318條，多態性位點 （P）平均為95.09%。平均每對引物擴增出11.89條帶，其中11.36條具有多態性，多態位點最多的為17個，最少的為9個；多態信息含量（PIC）范圍為0.23（me3＋em3）到0.44（me1＋em10），平均為0.33；表明供試菊苣材料種質間SRAP變異大，多態性高，存在豐富的遺傳多樣性（表3）。

表3 28對SRAP引物組合的擴增結果Table 3 SRAP results from 28 primer combinations

2.2 供試材料的遺傳多樣性分析

2.2.1 供試菊苣種質間親緣關系分析 對擴增結果采用Nei－Li相似系數（GS）計算方法，得到供試材料遺傳相似性矩陣，以此為依據分析材料間親緣關系。48份材料間的GS值范圍為0.55～0.89，平均GS值為0.69。其中PI652004（15號）和PI652005（16號），PI651985（17號）和 PI651986（18號）遺傳相似系數最大，為0.89，表明其親緣關系最近；材料PI651986（18號）和B－2－7（46號）的遺傳相似系數最小，為0.55，表明二者的親緣關系最遠。從遺傳相似性分析可知，菊苣具有非常豐富的遺傳多樣性（表4）。

2.2.2 供試材料各地理類群的遺傳多樣性指數地理類群間的遺傳相似系數分析表明，5個地理類群的GS值為0.63～0.96，法國類群和意大利類群的遺傳相似性系數最大為0.96，它們間的親緣關系最近。中國類群和法國類群的遺傳相似系數最小為0.63，表明兩類群的親緣關系最遠。這可能是由于法國和意大利同屬歐洲，相同或相似的生態地理環境加上自然突變、人為選擇及基因漂移的存在使得法國類群和意大利類群的菊苣在形態特征、生態類型和基因等方面保持了一定的趨同性，體現出較近的親緣關系。而中國類群和法國類群的菊苣位于不同的洲，地理隔離可能阻礙了相互間的基因交流，種質間的某些獨特的基因得以保留，使材料間體現出較大的遺傳變異。從多態性位點率（P）和香農指數（Shannon index）2個遺傳多樣性參數來看，5個類群遺傳多樣性水平從高到低的順序為：荷蘭＞意大利＞歐洲其他地區＞法國＞中國（表5）。

2.3 供試材料基于Nei－Li（Dice）遺傳相似性的聚類分析

基于遺傳相似系數，利用UPGMA法對供試材料進行聚類分析（圖1）。在遺傳相似系數為0.68處上把48份菊苣材料聚為5類，來自相同地區的材料能基本聚為同一類。

來自法國的10份材料聚為Ⅰ類。1號（PI 651933）和4號（PI 651936）之間的遺傳距離較遠，可能是因為1號（PI 651933）來自法國曼恩盧瓦爾省（Maine－et－Loire），屬于盧瓦爾河地區，該地區氣候溫和；而4號（PI 651936）來自法國埃松省（Essonne），該省是法國最干燥的省份之一，降水量較低。這種不同的地理位置和多樣的氣候變化，導致材料之間產生多樣性。

表4 供試材料間遺傳相似性系數Table 4 The genetic similarity index of accessions tested

續表4 Continued

來自意大利的13份材料聚為Ⅱ類。意大利屬于地中海沿岸國家，此地區屬于典型的地中海型氣候類型，夏季炎熱干燥，冬季溫和多雨，且該區多為山脈和高原，海岸線曲折，而這樣的氣候以及地理位置容易產生多樣的小生境。

來自荷蘭的10份材料聚為Ⅲ類。其中，15號（PI 652004）和16號（PI 652005），17號（PI 651985）和18號（PI 651986）之間的遺傳距離最近，可能是因為15號（PI 652004）和16號（PI 652005）來自同一個地方（South Holland），而 17 號（PI 651985）和 18 號（PI 651986）也來自同一個地區（Limburg），類似的生境和氣候導致了材料之間的一致性，由此可以看出，來自相同或者相似地理和氣候類型的材料能聚在一起，這為積累提供了合理性。來自歐洲其他地區的材料聚為Ⅳ類。

來自中國的材料聚為Ⅴ類。其中，45號 （B－1－1）和46號 （B－2－7）能最先聚在一起，這2份材料田間表現為葉片呈墨綠色，葉緣無鋸齒，且為根部分蘗。

從聚類結果可以看出，相同或相似地理來源和氣候類型的材料能基本聚在一起，說明遺傳多樣性與地理來源和氣候類型有一定的關系。

表5 菊苣不同地理類群遺傳多樣性指數Table 5 Different geographic group heredity multiple indices of C.intybus

圖1 菊苣的Nei－Li遺傳距離的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram for C.intybus based on Nei－Li genetic distance

2.4 菊苣主成分分析

對48份供試菊苣材料的SRAP標記的原始矩陣進行主成分分析，前3個主成分所能解釋的遺傳變異分別為17.27%，7.64%，5.47%，對48份菊苣種質做前3個主成分的三維排序圖（圖2），位置靠近者表示關系密切，遠離者表示關系疏遠，將位置靠近的菊苣材料劃歸為一類，可將供試材料分成五大類，結果表明主成分分析結果與聚類結果基本一致，同一地區的大部分材料基本能聚在一起，主成分分析結果更直觀地表明了不同菊苣材料的親緣關系。

3 討論

3.1 SRAP標記對菊苣遺傳多樣性研究的有效性

本研究利用SRAP標記技術分析了48份菊苣種質的遺傳多樣性關系。28對引物在48份菊苣基因組DNA中檢測到333個位點，多態性條帶比例為95.09%，材料間遺傳相似系數范圍為0.55～0.89，從而在分子水平上證明了不同菊苣之間差異較大，遺傳多樣性豐富。本實驗中，菊苣SRAP標記表現出較高的多態性（95.09%），由此可見，SRAP技術可以作為研究菊苣遺傳多樣性簡單、有效的方法。

3.2 菊苣種質遺傳變異與地理來源的相關性分析

遺傳變異和地理環境之間的關系一直是植物種群遺傳學研究中普遍關注的問題，多數研究認為種質的地理分布與分子標記間存在相關性［19］。在本次研究中這種相關性也得到了證明，研究利用28對引物對48份菊苣種質資源進行了SRAP統計分析和聚類分析，發現菊苣材料之間存在著比較高的遺傳分化。

圖2 基于SRAP譜型的菊苣材料主成分分析Fig.2 Principal component analysis based on SRAP patterns in C.intybus

聚類分析及主成分分析表明，供試菊苣材料呈現出較好的地域分布規律，這可能是由于菊苣材料在進化過程中受到自然選擇淘汰，自然選擇的結果使得個體中所發生的不定向變異造成群體遺傳結構的定向變異，這樣經過長時間的進化演變，同一地區大部分材料的基因型可能趨于相似，比如來自法國和意大利的材料可以單獨聚為一類。但是聚類也并非完全符合地域性的分布規律，比如來自葡萄牙（PI 652050，30號）和匈牙利（PI 652020）的材料能聚在一起，而來自波蘭的2份材料（PI 652007，23號和PI 652051，24號）沒能聚在一起，造成上述這種聚類劃分的現象可能有以下3個方面的原因：1）基因突變，物種在進化過程中，有個別的基因發生了變異，若該突變體能較好地適應當地的環境，這個變異基因就能得到保存；2）本研究材料來源于海拔、氣候特征和土壤類型等方面存在較大差異的地區，多樣的生境可能阻礙了種質間的基因漂移從而造成較大的遺傳差異，但在大的地理條件下如果存在相同或相似的生境條件，相同或相似的選擇壓力和生存環境導致遠距離間也可能會產生遺傳變異；3）是自然因素和人類活動造成的，風力輸送、江河沖刷、鳥類和人類交通工具的攜帶等都可能使其轉入異地擴展繁殖。

［1］焦春海.美國轉基因作物生產動態［J］.世界農業，2005，11：49－51.

［2］王孝華，阮培均，梅艷，等.玉米與菊苣不同密度間作實驗［J］.草業科學，2009，26（8）：137－140.

［3］Van Cutsem P，du Jardin P，Boutte C.，etal.Distinction between cultivated and wild chicory gene pools using AFLP markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2003，107：713－718.

［4］Baes P G，Van Cutsem P J.Chicory seed－lot variety identification by leucine－aminopeptidase and esterase zymogram analysis［J］.Electr－ophoresis，1992，13：885－886.

［5］Baes P G，Van Cutsem P J.Isozyme polymorphism in three gene pools of cultivated chicory （CichoriumintybusL.）［J］.Euphytica，1993，71：143－150.

［6］Kiers A M，Mes T，van der Meijden R，etal.A search for diagnostic AFLP markers inCichoriumspecies with emphasis on endive and chicory cultivar groups［J］.Genome，2000，43：470－476.

［7］Koch G，Jung C.Phylogenic relationship of industrial chicory varieties revealed by RAPDs and AFLPs［J］.Agronomy，1997，17：323－333

［8］王曉麗，凡星，張春，等.用nrDAN ITS序列探討小麥族含St H基因組物種的系統發育［J］.草業學報，2009，18（6）：82－90.

［9］范彥，李芳，張新全，等.扁穗牛鞭草種質遺傳多樣性的ISSR分析［J］.草業學報，2007，16（4）：76－81.

［10］劉偉，張新全，李芳，等.西南地區野生狗牙根遺傳多樣性的ISSR標記與地理來源分析［J］.草業學報，2007，16（3）：55－61.

［11］Ferriol M，Pico B，Nuez F.Genetic diversity of some accessions ofCucurbitamaximafrom Spain using RAPD and SBAP markers［J］.Genetic Resources and Crop Evolution，2003，50：227－238.

［12］Li G，Quiros C F.Sequence－related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103：455－461.

［13］Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，etal.Molecular characterization of Buffalograss germplasm using sequence－related amplified polymorphism markers［J］.Theoretical and Applied Genetics，2004，108：328－334.

［14］陳宣，郭海林，薛丹丹，等.結縷草屬植物耐鹽性SRAP分子標記研究［J］.草業學報，2009，18（2）：66－75.

［15］季楊，張新全，馬嘯，等.多花黑麥草品種（系）間雜交及其雜種后代SRAP遺傳分析［J］.草業學報，2009，18（4）：260－265.

［16］薛丹丹，郭海林，鄭軼琦，等.結縷草屬植物雜交后代雜種真實性鑒定－SRAP分子標記［J］.草業學報，2009，18（1）：72－79.

［17］Roldan－Ruiz I，Dendauw J，Van Bockstaele E，etal.AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses（Loliumspp.）［J］.Molecular Breeding，2000，6：125－134.

［18］Rohlf F J.NTSYS－pc：Numerial Taxonomy and Multivariate Analysis System（Version 2.0）［M］.New York：Exter Software，1994.

［19］Wilson B L，Kitzmiller J，Rolle W，etal.Isozyme variation and its environmental correlates inElymusglaucusfrom the California Floristic Province［J］.Canadian Journal of Botany，2001，79：139－153.