高粱棕色中脈基因bmr－6的遺傳分析和SSR標記定位

李杰勤，王麗華，詹秋文，范軍成

（安徽科技學院植物科學學院，安徽 鳳陽233100）

高粱（Sorghumbicolor）是禾本科一年生草本植物，因其具有抗旱、耐澇、耐鹽堿和適應性強等特性，是世界第五大糧食作物，同時又是一種優質飼料作物［1－3］。棕色中脈（Brown midrib，bmr）是指葉脈和莖稈木質部呈棕灰或紅棕色的自然或化學突變體。研究發現［4］，葉片中脈顏色與木質素含量和組成有著密切關系。一般認為總木質素含量和木質素單體的組成比例對細胞壁的可消化性影響較大［5］。在飼用高粱及高粱－蘇丹草（Sorghum sudanense）雜交種中，棕色中脈與傳統的白色中脈品種相比，其葉和秸稈中家畜可消化的纖維素和半纖維素含量增加，而難以消化的木質素含量降低40%～60%，極大地提高了葉和秸稈的適口性，各種放牧家畜特別喜食，同樣的飼喂量可獲得更高的效益。因此利用棕色中脈突變體來改善飼用高粱及高粱－蘇丹草雜交種品質引起了各國研究者的廣泛關注。

1924年，棕色中脈突變體首先在玉米（Zeamays）中被發現，接著在高粱、珍珠粟（Pennisetumamericarum）等作物中陸續被發現［6，7］。高粱中的棕色中脈類型較多，目前已經報道的類型有19種，其中既有自然突變體也有化學突變體［8］。在這些類型中，最重要的主要有bmr－6、bmr－12和bmr－18三種類型［9，10］。因為這3種類型的可消化率遠高于其他類型，因此應該是與木質素合成有關的基因發生突變的結果。等位分析證明bmr－12和bmr－18是等位基因，bmr－6和bmr－12位于不同的染色體上［11］。日前，bmr－12和bmr－18基因已經克隆，但 bmr－6基因定位還未見相關報道。

本研究利用從美國引進的高粱棕色中脈材料（bmr－6類型）與白色中脈材料的雜交F2分離群體，分析了高粱棕色中脈基因bmr－6的遺傳特點，并利用分子標記對bmr－6進行了基因定位，為進一步對bmr－6基因的克隆和利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棕色中脈材料N592是由美國Nebraska－Lincoln大學提供。N592是由N121（bmr－6）與Rox Orange進行多代回交選育而成。

1.2 定位群體的構建

將高粱棕色中脈材料N592分別和白色中脈材料Sa和S722分別進行雜交，獲得F1代。將F1植株單穗進行套袋自交，獲得F2代分離群體。2008年將該群體種植在安徽科技學院農場中，種植密度為行距50 cm，株距30 cm，常規肥水管理。

1.3 定位親本葉中脈組織切片

在能辨別棕色中脈和白色中脈性狀的6葉期，取N592和Sa的葉中脈，徒手切片，切片置于載玻片上，加入1滴間苯三酚／鹽酸試劑（2 mol／L鹽酸，1% 間苯三酚，溶于95%乙醇），室溫放置1 min后，觀察拍照。

1.4 χ2測驗

1.5 DNA提取

在6葉期對F2單株的棕色中脈單株進行統計，并取幼嫩葉片。同時取N592和Sa雙親的幼嫩葉片，并做好編號標記。

DNA的提取方法，參照Brown等［12］的方法，取嫩葉片0.5 g，加液氮研磨成粉末，加500 m L提取液（65℃）搖勻，65℃溫浴30 min；加20μL KAC（預冷），冰浴20 min，禁止搖動；加400μL氯仿／異戊醇（24∶1）搖勻，10 000 r／min離心10 min；取上清液于離心管中，加入預冷的無水乙醇；吸出位于液面上白色絮狀物DNA，之后用70%的乙醇沖洗2次，加無水乙醇脫水1次，保存。

1.6 SSR反應體系

采用25μL體系：10×Buffer（無 Mg2＋）2.0μL，MgCl22.0μL（25 mmol／L），引物：前引物1.0μL（10 μmol／L），后引物1.0μL（10μmol／L），d NTP 2.0μL（25 mmol／L），模板DNA 2.0μL（50 ng／μL），雙蒸水14.8 μL。

1.7 SSR標記分析

選取均勻分布在高粱10個連鎖群上的171對SSR引物進行PCR擴增。SSR引物為txp系列，具體名稱和分布見表1，引物序列參考網站www.gramene.org。SSR引物全部由biosino公司合成。

表1 高粱SSR引物名稱及分布Table 1 The SSR markers name and distribution on S.bicolor linkage group

1.8 PCR擴增

PCR反應按如下程序進行：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min循環36次，72℃延伸7 min，4℃保存。反應完成后，加入2.0μL的溴酚藍，3%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶（EB）染色，凝膠成像系統（PCR）拍照。

1.9 遺傳作圖

將在親本間有差異的SSR引物對隱性群體進行PCR擴增，將與母本條帶一致的個體賦值為0，與父本一致的為1，雙帶為2。將群體基因型數據歸類，用Exp 3.0b作圖軟件進行連鎖分析［13］，采用Kosambi函數將重組值轉換為遺傳圖距。

2 結果與分析

2.1 N592和Sa的葉中脈表型及其組織切片

普通高粱葉中脈有4種顏色，即白色、綠色、黃色和淺灰色。N592為淺棕色，Sa為白色。兩者在顏色上差別較大，但衰老葉片的葉色中脈都為白色。因此，在收獲棕色中脈的飼用高粱要早于普通飼用高粱，以便于減少營養損失。

間苯三酚是一種用來檢測植物組織中木質素的常用試劑。木質素能和間苯三酚／鹽酸試劑產生紅色的化合物。因此，如果組織中紅色越深則說明木質素含量越高，纖維素和半纖維素含量則相應降低。N592的紅色比Sa要淺得多（圖1），而且N592被染紅的主要分布在韌皮部，而Sa則在髓部、韌皮部、木質部及表皮都被染成了紅色。這也說明Sa的木質素含量要遠高于N592。

2.2 高粱棕色中脈基因的遺傳行為分析

以N592分別與Sa和S722進行雜交，獲得的F1代，葉脈表現全為白色中脈，這表明棕色中脈基因為隱性遺傳。將F1代進行套袋自交，獲得的F2代分離群體。F2分離群體中，白色中脈和棕色中脈分離符合1對等位基因的分離規律（表2）。通過χ2測驗，說明棕色中脈bmr－6受1對隱性等位基因控制。

2.3 N592和Sa引物篩選

由于N592和Sa雜交F2群體在數量上和χ2測驗的結果都優于N592和S722，因此選擇了N592和Sa雜交F2群體為定位群體。選擇了171對SSR標記對定位群體親本進行了PCR擴增，N592和Sa兩個親本間的SSR標記進行了多態性篩選。在擴增的171對引物中，24對能夠揭示親本間的多態性（圖2），多態性頻率為14.1%。

圖1 N592和Sa葉中脈組織切片Fig.1 The midrib histological section

表2 高粱棕色中脈基因的χ2測驗Table 2 Theχ2 test of sorghum brown midrib gene

圖2 定位親本間多態性引物篩選Fig.2 Screening of SSR markers in parents

圖3 SSR標記txp295在F2隱性群體中的部分擴增結果Fig.3 Amplification of txp295 in F2 recessive population

2.4 共分離標記的篩選

應用在雙親間表現多態性的24對差異標記，對122個F2棕色中脈單株進行PCR擴增（圖3）。對標記和基因進行了連鎖性分析，發現位于第1連鎖群的SSR標記txp295與目的基因連鎖。經Mapmaker分析，用Kosambi函數將重組值轉換為遺傳圖距，連鎖距離為4.2c M。因txp295位于第7連鎖群（表1），初步將該基因定位于第7連鎖群上（圖4）。

圖4 棕色中脈基因在高粱第7號連鎖群上的遺傳圖Fig.4 The genetic map of bmr－6 gene on S.bicolor linkage group 7

本研究采用基因定位方法來對bmr－6基因進行了初步定位，為進一步的基因精細定位奠定了基礎。同樣的方法也在高粱棕色中脈基因bmr－26的定位上被采用［14］。利用已有的分子圖譜對基因進行初步定位，再以這一標記為基點，進行加密探針，可以大大的縮小標記選擇的范圍，為目標基因精細定位打下基礎［15］。本研究利用已公布的高粱分子圖譜中的SSR標記，將棕色中脈基因直接定位到已知連鎖群上，為進一步篩選引物和該基因精細定位打下了基礎，同時也為利用分子標記輔助選擇進行棕色中脈品種的選育創造了條件。

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