體外感染實驗探討丙型肝炎病毒的ADE分子機制*

聶青和 羅新棟 黃曉峰 張亞飛 程勇前

丙型肝炎病毒（HCV）在我國一般人群中的感染率約為3.2%。1991年后由于已對獻血員常規(guī)進行HCV的篩檢，使輸血后丙型肝炎的發(fā)生率大為減少[1]，但預(yù)防母嬰間宮內(nèi)、分娩時及產(chǎn)后感染HCV已成為當(dāng)前及今后研究的重要問題[2]。現(xiàn)研究證實，HCV可經(jīng)胎盤引起胎兒感染，宮內(nèi)感染是HCV傳播的一條重要途徑。目前有關(guān)這方面的研究多數(shù)為流行病學(xué)調(diào)查，至于HCV如何在母嬰間傳播的分子機制研究報道還甚少[3]。理論上說，HCV經(jīng)胎盤感染胎兒首先必須突破胎盤屏障的第一道防線，即滋養(yǎng)層細胞。近年來，國外學(xué)者在離體實驗中發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（HIV）、流感A病毒、貓感染性腹膜炎病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒等二十余種病毒在感染過程中存在抗體依賴的感染增強作用（ADE）[4]。HIV-1的ADE作用機制比較復(fù)雜，可能包括多種途徑同時起作用，其中由FcγRⅢ（CD16）介導(dǎo)的進入滋養(yǎng)層細胞的ADE機制已經(jīng)初步被證實。在HCV感染胎兒過程中是否也存在ADE作用機制？因而我們推測，HCV宮內(nèi)感染存在同樣的分子機制，其感染滋養(yǎng)層細胞需FcγRⅢ受體的非特異性介導(dǎo)。

材料與方法

一、主要試劑 Percoll細胞分離液為美國Pharmacia公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)染色用ABC試劑盒及HCV RNA定性檢測試劑盒購自華美公司；細胞角蛋白及波形蛋白抗體購自寶泰克公司；QIAmp viral RNA提取試劑盒為德國Qiagen公司產(chǎn)品；CD81和LDL-R鼠抗人單克隆抗體（McAb）均為Serotec公司產(chǎn)品。CD16鼠抗人單抗由本校免疫教研室歐陽為明博士惠贈；小鼠HCV NS5及NS3 McAb由北京大學(xué)人民醫(yī)院魏來教授惠贈；小鼠HCV-C（CP10）McAb由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院郝飛教授惠贈；SPA-膠體金（5nm）購自武漢博士德生物技術(shù)公司。

二、引物 由寶生物（大連）有限公司合成。F外（493～518）：5’-GCAACAGGGAACCTT CCTGGTTGCTC-3’，R外（987～964）：5’-CGTAGGGGCCAGTTCATCATCATCATCAT-3’，F(xiàn) 內(nèi) （502 ～527）：5’-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3’，R 內(nèi) （957 ～952）：5’-GTTCATCATC ATATCCCATGCCAT-3’，內(nèi)引物擴增的cDNA長度為474bp。

三、HCV陽性血清 取自我科住院的丙型肝炎患者，經(jīng)檢測HAV、HBV、HDV、HEV標(biāo)志物均陰性，抗-CMV、抗-EBV、抗-HIV均陰性；抗 HCV陽性，HCV RNA為2.1×106copies/ml。HCV基因分型為Ib型，患者尚未經(jīng)抗病毒藥物治療。無菌采集血清，分裝后-20℃凍存，用前經(jīng)56℃、30min滅活補體。正常血清來自門診體檢人員，經(jīng)檢測 HAV、HBV、HCV、HDV、HEV標(biāo)志物均陰性，抗-HIV陰性，肝功能正常。

四、體外細胞培養(yǎng)[5]取健康（血清HBV、HCV標(biāo)志物均陰性，抗-HIV陰性，肝功能正常）妊娠6～10周孕婦新鮮流產(chǎn)胎兒胎盤組織。以Percoll等密度梯度沉降法純化滋養(yǎng)層細胞，倒置顯微鏡下觀察其生長特性，并采用ABC法檢測細胞角蛋白、波形蛋白表達以對培養(yǎng)細胞進行鑒定。

五、體外細胞感染 將對數(shù)生長期的滋養(yǎng)層細胞棄去上清，分別用1ml抗HCV陽性血清和正常血清，置于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)2h，加入DMEM（不含小牛血清）3ml過夜。次日棄去上清，用1×PBS洗滌7次，再加入含10%小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵化2天，以透射電鏡檢測細胞內(nèi)HCV顆粒。剩余的感染細胞重復(fù)感染1次，2天后進行免疫電鏡法檢測（采用包埋前反應(yīng)法）[6]。另將4瓶滋養(yǎng)層細胞培養(yǎng)24小時后，留取上清待檢。然后按照以下方式進行感染：（1）對照組：加入20%正常血清；（2）補體滅活組：加入20%HCV RNA陽性血清（經(jīng)56℃、30min滅活補體）；（3）CD16 McAb組：先以含 1：150 CD16 McAb的培養(yǎng)液與細胞在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，棄去，更換含HCV RNA陽性血清（未滅活）和20%高糖DMEM培養(yǎng)液；（4）全血清組：加入含HCV RNA陽性血清（未滅活）和20%高糖DMEM培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24h后，以高糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞5次，留取最后一次洗液待檢。培養(yǎng)瓶內(nèi)重新加入完全高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后每3天收集培養(yǎng)上清和細胞，然后再加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，保持培養(yǎng)液體積4ml。共觀察21天，每次收集的上清和細胞立即提取RNA儲存供檢測用。

六、RNA提取及HCV RNA正鏈檢測 將各組細胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24小時后，以高糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞5次。培養(yǎng)瓶內(nèi)重新加入完全高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染3天后收集培養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，然后取細胞懸液200μl，用QIAmp viral RNA 提取試劑盒提取細胞內(nèi)病毒RNA，操作步驟按說明書進行。然后收集病毒RNA，采用ROCHE Lightcycler熒光PCR檢測儀定量檢測（深圳匹基生物技術(shù)開發(fā)有限公司，拷貝數(shù)＜102copies/ml為陰性）。

七、HCV RNA負鏈檢測 檢測材料為以上各組細胞提取的細胞內(nèi)RNA和培養(yǎng)液上清RNA。取出凍存RNA，60℃水浴 5min以解聚。反應(yīng)體系：RNA10μl、4dNTP2μl、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 5 ×buffer4μl、RNasin1μl、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl、F 外 2μl混勻后，42℃保溫 2h進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。結(jié)束后95℃ 5min滅活A(yù)MV酶。第一次PCR循環(huán)：反應(yīng)體系：cDNA2μl、F外、R 外各 1μl、4dNTP2μl、Taq 酶 10×buffer2μl、Taq酶 0.5μl、MgCL21.5μl、DEPC 純水 10μl混勻后，滴加兩滴液體石蠟，離心數(shù)秒鐘，按下列參數(shù)進行擴增。預(yù)變性：95℃ 300s、94℃ 60s、56℃ 60s、72℃ 60s，共 35個循環(huán)，終延伸72℃ 300s；第二次PCR循環(huán)：反應(yīng)體系：第一循環(huán)產(chǎn)物 2μl、F 內(nèi)、R 內(nèi)各 1μl、4dNTP2μl、Taq 酶 10×buffer2μl、Taq 酶 0.5μl、MgCL21.5μl、DEPC純水10μl混勻后，滴加兩滴液體石蠟，離心數(shù)秒鐘，按下列參數(shù)進行第二次擴增。預(yù)變性：95℃ 300s、94℃ 60s、58℃ 30s、72℃ 60s，進行35個循環(huán)，終延伸72℃ 300s。各組細胞在感染后6天用細胞爬片同時進行HCV NS5、NS3和C區(qū)抗原的免疫組化檢測，使用華美公司ABC試劑盒，按說明書步驟操作。

八、細胞內(nèi)HCV包膜蛋白的免疫電鏡檢測 將PBS洗滌后的細胞1000r/min離心20min后，4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液固定1h。加入1%Triton X-100（以 0.05mol/L TBS配制）37℃作用 10min；0.05mol/L TBS洗滌3次后加入1%牛血清白蛋白（BSA）37℃處理30min。感染組和對照組分別加入1：150的鼠抗HCV E2包膜蛋白多克隆抗體，置37℃1h。0.02mol/L TBS洗滌3次，再經(jīng)1%BSA于37℃處理30min后，加入1：200膠體金標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃作用1h。用0.02mol/L TBS洗滌10min，再用0.05mol/L PBS洗滌3次；加入1%BSA，2000r/m離心10min，棄上清。加入4%戊二醛使細胞固定成團，于LKBⅢ型切片機上做超薄切片（500埃），在本校電鏡室透射電鏡（日本Jeol公司JEM-100SX 型）下觀察。

結(jié) 果

一、透射電鏡觀察 分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞呈不規(guī)則多角形，核大，呈卵圓形，位于胞質(zhì)近中央，胞漿豐富透明，細胞呈片狀鋪展生長。透射電鏡下，可見培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細胞外有大量的微絨毛，偶見包被陷窩，胞質(zhì)中線粒體大而多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與糖原顆粒清晰可辯，還可見到電子密度高的脂滴。經(jīng)鑒定培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞純度超過95%。透射電鏡下可見HCV感染的滋養(yǎng)層細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)清晰，有明顯的絨毛樣突起，細胞核呈膜狀結(jié)構(gòu)包繞的電子密度較高區(qū)域。可明顯分辨出胞漿中的線粒體、溶酶體等細胞器。部分細胞中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張和空泡樣變，有部分細胞胞漿內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見病毒樣顆粒，顆粒大小為50nm左右，表現(xiàn)為周圍有電子密度較低的膜狀結(jié)構(gòu)包繞，中間有電子密度較高的物質(zhì)（可能為其遺傳物質(zhì)），形狀近圓形。還可以見到病毒進入細胞過程中形成的吞噬小泡，有的病毒樣顆粒附近可見溶酶體聚集，同時溶酶體內(nèi)也可見病毒樣顆粒，可能反映了細胞對病毒的防衛(wèi)作用。對照組細胞超微結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器形態(tài)無改變，也未見有病毒樣顆粒。

二、免疫電鏡觀察 免疫電鏡下可見細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)清晰，感染細胞胞漿表現(xiàn)與透射電鏡相似，細胞內(nèi)可見散在膠體金顆粒，細小的膠體金顆粒呈分散分布，也有膠體金顆粒呈簇狀附著于病毒樣顆粒鄰近，提示胞漿中可能有HCV NS5抗原存在（圖1）。有的胞漿內(nèi)見電子密度大的金標(biāo)顆粒，吸附于病毒樣顆粒上，病毒樣顆粒約為60μm（圖2）。對照1組細胞內(nèi)未見病毒樣顆粒，對照2組細胞內(nèi)可見病毒樣顆粒，但無膠體金顆粒黏附。

圖1 胞漿內(nèi)散在膠體金及病毒顆粒

圖2 膠體金顆粒附著于病毒表面

三、感染細胞HCV的存在 在培養(yǎng)21天時，可在全血清組的細胞內(nèi)和上清液中間斷測得HCV RNA正鏈；在補體滅活組、CD16 McAb組細胞內(nèi)和上清液中均未檢測到（表1、圖3）。感染前培養(yǎng)液及感染后最后留取的洗液檢測均為陰性。在培養(yǎng)21天時僅在全血清組的細胞內(nèi)檢測到2次HCV RNA負鏈，其余組均為陰性；各組培養(yǎng)上清中均未測到病毒核酸（表 2、圖 4）。在全血清組可見到 NS3、NS5、C 區(qū)蛋白陽性信號，表達于胞漿中（圖5），其余各組未見表達。

表1 細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液HCV RNA正鏈的存在

表2 細胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液HCV RNA負鏈的存在

圖3 細胞內(nèi)HCV RNA正鏈的存在

圖4 細胞內(nèi)HCV RNA負鏈的存在

圖5 全血清組細胞病毒蛋白的表達（ABC，×100）

討 論

關(guān)于HCV顆粒形態(tài)，目前以日本Kaito的報道比較可信[8]。他們用兔抗HCV膜蛋白多克隆抗體為一抗，膠體金標(biāo)記羊抗免IgG為二抗的間接免疫電鏡技術(shù)，首次較清楚地顯示了HCV形態(tài)。他們描述HCV直徑為55～65nm，但陳良標(biāo)等根據(jù)論文照片提供的標(biāo)尺測量，病毒的實際大小是：含包膜的完整病毒直徑為100～115nm，內(nèi)含直徑55～65nm圓球形核心或核殼體，核殼體表面6nm長的細釘狀突起，可能是病毒核殼體的子粒結(jié)構(gòu)。本研究參照國外學(xué)者用HCV感染體外培養(yǎng)細胞的方法，對滋養(yǎng)層細胞進行感染實驗。我們采用電子顯微鏡技術(shù)直接觀察轉(zhuǎn)染細胞內(nèi)HCV顆粒及細胞的超微結(jié)構(gòu)改變，感染后的細胞胞質(zhì)內(nèi)存在許多病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)，核心直徑約為50nm左右，有明確的外膜和棘突，完整病毒顆粒直徑約100nm左右。進行間接免疫電鏡檢測，發(fā)現(xiàn)病毒外膜有膠體金顆粒特異性標(biāo)記，證明所見確為HCV顆粒。這也是判定HCV感染滋養(yǎng)層細胞是否成功的一個可靠標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，病毒感染中的ADE作用越來越受到人們的重視。所謂ADE作用指抗體依賴的感染增強作用，即特異性抗體對病毒感染有促進作用。一般來說，機體產(chǎn)生的病毒抗體或者對病毒有中和及抵抗作用，或者是一些無中和作用的抗體，ADE則主要表現(xiàn)在有特異性抗體存在的情況下，病毒在體外培養(yǎng)的細胞中數(shù)量增多和（或）病毒感染的動物癥狀加重或出現(xiàn)早死現(xiàn)象，從而引起疾病的進展、導(dǎo)致疾病的進一步惡化及對疫苗的應(yīng)用產(chǎn)生明顯的影響。此時抗體多在中度水平或亞中和滴度水平與病毒形成病毒-抗體復(fù)合物，易感細胞具有Fc受體（FcR）或補體受體（CR）。最初ADE的發(fā)現(xiàn)僅僅局限于抗體，隨后發(fā)現(xiàn)不僅抗體而且抗體及補體的復(fù)合物，甚至單純補體同樣有增強作用。故現(xiàn)在該定義實際上為一種泛指的、與補體及抗體相關(guān)的、增強病毒感染的作用。

經(jīng)血液或血制品傳播是HCV的主要傳播途徑，但在HCV感染者中只有約50%的人有血及血制品暴露史或其它可確認的傳染途徑，進一步研究表明還存在其它非經(jīng)血液傳播途徑。隨著對血制品檢測的加強及檢測技術(shù)的提高，HCV經(jīng)輸血傳播的發(fā)生率已大大降低[9]，而對HCV存在的母嬰傳播途徑開始重視起來。我們曾用熒光定量PCR技術(shù)檢測HCV感染孕婦羊水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊水中HCV RNA陽性率極低，僅為5.9%。提示羊水傳播不是HCV母嬰傳播的主要途徑[10]。從早期接觸、長期持續(xù)接觸等特點分析，理論上講HCV經(jīng)胎盤感染的可能性最大。

近年來，有關(guān)IgG穿越胎盤具體機制的研究取得了很大的進展。在胎盤絨毛組織中FcγRⅢ（CD16）僅分布于胎盤屏障的最外層，即滋養(yǎng)層細胞層。推測IgG穿越胎盤屏障通過如下分子機制模式：即由滋養(yǎng)層細胞上的FcγRⅢ介導(dǎo)IgG最初的內(nèi)吞活動，在酸化內(nèi)吞體中，IgG可從受體中釋放，釋放的IgG與位于內(nèi)吞體表面的hFcRn特異性結(jié)合，通過胞吞轉(zhuǎn)運作用而至合胞體滋養(yǎng)層細胞堿性一側(cè)，IgG從hFcRn上解離，進入毛細血管內(nèi)皮，由位于毛細血管內(nèi)皮上的FcγRⅡ介導(dǎo)，最終進入胎兒血液[11，12]。

已有報道表明，在母體內(nèi)的HIV-1病毒與其抗體形成復(fù)合物，然后由滋養(yǎng)層細胞表面的FcγR介導(dǎo)復(fù)合物內(nèi)化，從而導(dǎo)致胎盤細胞的病毒感染，機制屬于經(jīng)典的ADE形式之一[13]。因此，HCV的母嬰傳播很可能與之相似。

本實驗結(jié)果初步證實，在HCV感染滋養(yǎng)層細胞的過程中存在ADE現(xiàn)象。而缺乏補體或者應(yīng)用CD16單克隆抗體則明顯影響HCV進入滋養(yǎng)層細胞，免疫組化實驗不能發(fā)現(xiàn)HCV NS5、NS3及C區(qū)抗原的表達，說明抗體和補體均參與HCV的跨膜轉(zhuǎn)運過程，但是兩者的主次關(guān)系未明，也可能是單獨的2種ADE途徑。在全血清感染細胞檢出HCV RNA負鏈，說明HCV能在滋養(yǎng)層細胞中復(fù)制，ADE可能起了增強作用。最近有關(guān)ADE研究結(jié)果表明，病毒經(jīng)過Fc R-ADE進入細胞，可以通過抑制抗病毒基因的表達而增強復(fù)制，這也屬于增強的感染結(jié)果。HCV感染細胞后21天在細胞內(nèi)外均不能檢出HCV RNA正、負鏈。由于患者的抗體僅僅是定量檢測，所以本實驗中HCV抗體滴度與HCV的ADE現(xiàn)象關(guān)系不明確，而且參與ADE的補體種類也有待進一步查明。滋養(yǎng)層細胞也并非HCV的靶細胞，HCV感染及復(fù)制均較困難。因而我們推測，HCV宮內(nèi)感染存在同樣的分子機制，其感染滋養(yǎng)層細胞不需要已知HCV感染特異性靶受體（CD81分子和LDLR分子）的介導(dǎo)，而僅需FcγRⅢ受體的非特異性介導(dǎo)。本實驗初步證實了我們的科研課題設(shè)想。

ADE給HCV疫苗研制帶來了新的研究課題[14]。HCV進入滋養(yǎng)層細胞時ADE的準(zhǔn)確分子機制，以及如何經(jīng)過內(nèi)化作用跨膜轉(zhuǎn)運，進入細胞后是否抑制宿主抗病毒基因的表達等，均有待進一步深入研究闡明。

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