H22荷瘤小鼠下丘腦一致上調和下調的基因*

顏 彥，方肇勤△，劉小美，潘志強，盧文麗，梁 超，吳中華，高必峰

(1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203;2.科羅拉多大學醫學院，美國丹佛 CO 80262)

我們前期通過業已建立的小鼠四診工作站及其系列標準[1～4]，對 H22荷瘤小鼠進行辨證，篩選出早期邪毒壅盛證、氣虛證、中期陽氣虛證、中晚期氣陰陽虛證等3個階段4個常見證型，繼而采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array基因芯片對上述4種證型小鼠下丘腦、垂體、腎上腺、甲狀腺、睪丸、胸腺、脾臟和腫瘤等8種組織進行檢測。發現在腫瘤發生后，這些組織出現大量的基因表達和剪接差異。本文重在關注腫瘤發生后下丘腦在3階段4個證候中一致上調或下調且至少有1個證候表達量大于1000的基因，共30個。

1 材料

1.1 動物

昆明種雄性小鼠250只，體重25g±1g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(滬)2003-0003。

1.2 試劑與儀器

Trizol試劑和RNeasy Mini Kit試劑盒分別購自美國GIBCO BRC和德國QIAGEN公司，RNA Nano LabChip及其配套的 Agilent-bioanalizer2100。GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其試劑盒(2006年)。四診計量化檢測設備見相關文獻[2];芯片檢測儀器包括雜交爐、芯片洗滌系統、芯片掃描儀等均購自美國Affymetrix公司。

2 方法

2.1 分組及處理

隨機取60只作正常對照，另190只腋下接種H22腫瘤腹水癌細胞0.2ml(濃度4×107個/ml)，出瘤后淘汰40只出瘤不佳及畸形小鼠，剩余150只。取正常小鼠20只及荷瘤小鼠150只，共計170只用于四診計量檢測和辨證，另40只正常對照小鼠不做四診檢測，常規飼養。

2.2 四診計量化檢測方法與計量辨證方法

參見有關文獻[1～3]。

2.3 荷瘤小鼠分期與常見證候的確定

依據以往的研究，H22荷瘤小鼠分期標準參見有關文獻[4]。分別于接種腫瘤后第7天(早期)、第20天(中期)、第28天(中晚期)進行全體小鼠四診檢測與辨證。并分別于檢測后的次日，即接種腫瘤后第8天(早期)，辨證并篩選出最為典型的邪毒壅盛、氣虛證候小鼠各16只;第21天(中期)辨證并篩選出最為典型的陽氣虛證候小鼠16只;第29天(中晚期)辨證并篩選出最為典型的氣陰陽虛證候小鼠16只。

2.4 不同證候荷瘤小鼠的處死與取材

在小鼠四診檢測與辨證的次日，即分別于接種腫瘤后第8天，處死邪毒壅盛、氣虛證荷瘤小鼠，以及正常對照小鼠各16只;第21天處死陽氣虛荷瘤小鼠和正常對照小鼠各16只，第29天處死氣陰陽虛荷瘤小鼠和正常對照小鼠各16只，分別取下丘腦、垂體、甲狀腺、腎上腺、睪丸、胸腺、脾臟和腫瘤組織，稱重和計算各組織與正常對照小鼠對應組織重量均數的比值。

2.5 RNA的提取與檢測

以上共5組樣本采用Trizol(GIBCO BRC)試劑盒及其方法，抽提以上組織總RNA，16個組織樣本合并混勻;采用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)試劑盒及其方法純化RNA;采用RNA Nano LabChip和方法，及其配套的Agilent-bioanalizer2100檢測RNA的質量和電泳圖譜。

2.6 芯片檢測

采用Affymetrix的GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array及其試劑盒所建議的檢測方法。依據檢測結果和Affymetrix建議的方法，采用iterPlier法計算核心基因表達讀數值以及外顯子剪接差異分析。以上RNA檢測和芯片檢測委托上海生物芯片有限公司完成。

2.7 下丘腦在3階段4個證候中一致上調或下調且至少有1個證候表達量大于1000的基因的篩選

(1)選取5組(正常和4個證候組)表達量至少有1組≥432(5組所有基因表達的均數)的基因，共6035個，此步驟保證初步表達量;(2)篩選4個證候與正常組比值至少有1組大于或等于1.5，以及小于或等于0.67的基因，共2109個;(3)篩選一致上調的基因:4個證候與正常組比值一致大于1.5，且至少有1個證候大于1000的基因;(4)篩選一致下調的基因:4個證候與正常組比值一致小于0.67的基因。

2.8 基因信息查詢

中文搜索CNKI、VIP等數據庫，英文主要參考NCBI數據庫中的 PubMed、OMIM、OMIA等收載的文獻。

3 結果

3.1 分期處死的荷瘤小鼠

整個實驗期間，先后分3階段處死4個不同證候荷瘤小鼠計64只，即腫瘤早期的“邪毒壅盛證”、“氣虛證”，中期的“陽氣虛證”(氣虛兼有陽虛)和中晚期的“氣陰陽虛”兼證各16只。實驗中自然死亡32只，尚存活54只，并涉及一些其他復合證。

3.2 荷瘤小鼠下丘腦差異表達的基因數

荷瘤小鼠下丘腦一致上調且至少有1個證候大于1000的基因共27個，其中氣虛證表達最大的11個，陽氣虛證表達最大的1個，氣陰陽虛證表達量最大的15個，一致下調的基因共3個。

3.3 荷瘤小鼠下丘腦一致上調的基因

3.3.1 荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達上調的基因 表1顯示，荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達上調且芯片讀數計算值大于1000的基因共11個。

Lphn1為 7TM-受體外緣凝集素樣結構域。7TM-受體被認為是信號傳輸過程中的信號轉換器，參與信號轉導。對拉特羅毒素有強吸引，可引發大規模神經元和神經內分泌細胞的胞吐作用。有報道認為其可能與胞吐調節有關，具體機制不詳[5]。

Ctxn1在前腦發育過程中調節皮質神經元的細胞內外信號傳遞。

Syn1是突觸蛋白家族成員，人類補體旁路途徑的正調節物，分布在突觸膜泡和突觸小泡的細胞質表面，與細胞骨架相結合，參與突觸傳遞和神經遞質分泌的調節，對突觸功能障礙和衰老過程中神經細胞的生存有重要影響。Syn1的細胞缺失會導致抑郁與癲癇[6]。

Ttyh3與氯離子通道有關。編碼蛋白質的功能是鈣離子激活大量氯離子通道進行信息傳遞。

Npcd是帶有染色質域的神經元五聚環蛋白，主要存在于細胞體、凸起以及生長錐中，與神經元的質膜內側相關，Npcd可能與軸突生長或導向有關，可影響神經生長因子，誘導神經細胞分化[7]。

Nr1d1是核受體亞家族成員，參與和調控基因轉錄過程，通過影響生物節律來調節代謝，對調節血脂、核脂蛋白代謝、脂肪形成和血管炎癥有重要作用[8]。

表1 荷瘤小鼠早期氣虛證下丘腦表達上調的基因(芯片讀數計算值)

Nt5dc3能選擇性地與核苷酸相互作用，形成核糖核蛋白復合物，可能參與RNA的轉錄和翻譯，具體功能未見文獻報道。

C530028O21Rik的功能不清楚。

CD74可通過影響MHCⅡ類抗原分子多肽的組裝及其基因的表達，在抗原呈遞過程中發揮重要作用。研究顯示，細胞表面CD74可控制成熟B細胞的存活率[9]。CD74表達量增加，提示機體的免疫機能可能較活躍。

Nfix在病毒和細胞的啟動因子和復制起始區中識別和結合回文序列 5′-TTGGCNNNNNGCCAA-3′，這些蛋白單獨能夠激活轉錄和復制。對維持大腦發育和神經干細胞穩態有重要作用[10]。

Mast3是絲氨酸/蘇氨酸激酶家族成員，研究表明該基因與大腦神經活動密切相關，傳遞信息。有研究顯示，其在海馬樣癲癇中表達量上升[11]。

以上 Ctxn1、Lphn1、Npcd、Syn1、Mast3、Ttyh3 均與細胞特別是神經細胞的信號傳遞有關，Nfix、Nr1d1、Nt5dc3與基因的轉錄和翻譯有關，CD74與機體的免疫功能有關。腫瘤發生后，4個常見證候荷瘤小鼠下丘腦的這些基因一致上調，其中又以氣虛證表達量最高，提示荷瘤小鼠下丘腦內神經細胞間相互作用增強，以早期的氣虛證為甚。下丘腦的一些神經元既能分泌激素(神經激素)，具有內分泌細胞的作用;又保持典型神經細胞的功能，可合成調節腺垂體激素分泌的肽類物質。這些肽類物質合成后必須經軸突運輸到正中隆起，由此經垂體門脈系統到達腺垂體，促進或抑制某種腺垂體激素的分泌。由以上結果推測腫瘤發生后下丘腦的內分泌功能可能有所增強，以氣虛證為甚。但具體到哪種激素?促進性或抑制性激素哪個占優勢，尚待進一步分析。

3.3.2 荷瘤小鼠中期陽氣虛證下丘腦表達上調的基因 表2顯示，荷瘤小鼠中期陽氣虛證下丘腦表達上調且芯片讀數計算值大于1000的基因僅1個。

Dusp8分布在細胞核和細胞質，參與抑制促分裂素原活化蛋白激酶和蛋白氨基酸去磷酸化過程。小鼠主要在腦部和肺有表達。Nesbit等用熒光原位雜交方法發現，Dusp8雜合子丟失可導致腫瘤發生[12]。

3.3.3 荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達上調的基因 表3顯示，荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達上調且芯片讀數計算值大于1000的基因共15個。

Ptms分布在細胞核中，與細胞周期、DNA復制、細胞防御應答和發育有關，可以通過阻斷胸腺旁腺素α抵制某些機會性感染來達到調節免疫功能的目的。

Eif3s5和Eif5a均與蛋白質的合成有關。Eif5a參與真核細胞翻譯起始過程。研究顯示，Eif5a只參與翻譯后合成多胺源性氨基酸，也與蛋白質的合成有一定關系。Eif3s5則參與蛋白生物合成和調控翻譯啟動[13]。

S100a8分布在胞外區，與鈣離子結合參與炎癥應答。S100蛋白廣泛存在于細胞的細胞質和/或核中，并參與調節一些細胞過程如細胞周期和分化。正常小鼠以及早期荷瘤小鼠下丘腦S100a8的表達幾乎關閉，中期、中晚期表達突然持續大幅上升，這與此基因在垂體的表達趨勢一致，提示荷瘤小鼠中期和中晚期可能出現一些炎癥反應[14]。

Ap1g2和Ap2a1主要分布在細胞質的高爾基堆疊、衣被小凹等，參與蛋白復合體組裝、細胞內蛋白運輸、胞吞等過程，主要參與蛋白合成。

Syt3分布在突觸膜泡和突觸間，參與運輸轉運蛋白和鈣離子結合，在運輸和胞吐過程中穿過Ca2+和磷脂結合的C2域或作為Ca2+的傳感器。

表3 荷瘤小鼠中晚期氣陰陽虛證下丘腦表達上調的基因(芯片讀數計算值)

Lcn2是脂鈣蛋白的一種，分布在可溶片斷和細胞質中，參與運輸脂類轉運蛋白。也有研究發現，Lcn2可通過與細菌鐵載體結合以阻止細胞生長來影響細菌感染的先天免疫應答。

Sez6是腦特異性蛋白，可在細胞間的識別和神經元膜信號傳遞中發揮作用，在樹突復雜結構的信息加工過程中，對平衡樹突延伸段和分支起到重要的作用，參與正向刺激突觸連接，與癲癇發作有關。

Atn1分布在細胞核和細胞質中，參與中樞神經系統發育，引起的病變為齒狀核紅核蒼白球呂伊斯體萎縮(一種罕見的神經退行性疾病，包括小腦性共濟失調、肌陣攣性癲癇、舞蹈手足徐動癥及老年癡呆癥)。

Laptm5是溶酶體蛋白質，通過抑制T細胞表面抗原受體來調節免疫應答，以控制表面受體的表達和T細胞活化。

P140在小鼠主要在腦部、睪丸、肺、腎等組織表達，在細胞黏附于纖維蛋白的早期階段延遲細胞擴散，并與嗜鉻細胞瘤細胞系的鈣依賴性胞吐作用有關。

Bat2是關聯轉錄物，定位于腫瘤壞死因子α和β。此基因包含在人類主要組織相容性復合物Ⅲ類中，調節前體mRNA剪接，是免疫系統的介體。這種基因微衛星與胰島素依賴型糖尿病的發病年齡相關，并被認為可能在胰島素依賴型糖尿病發展過程中參與了炎癥過程中胰島β細胞的破壞。

BC033915和LOC620583的功能不清楚。

以上Bat2、S100a8與炎癥的發生有關，Laptm5、Ptms、Lcn2 均與免疫抑制有關，Sez6、Atn1、Syt3、P140與神經的發育以及神經間的信號傳遞有關，Eif5a、Eif3s5、Ap1g2、Ap2a1 與蛋白質的合成和運輸有關。腫瘤發生后，荷瘤小鼠下丘腦4個證候的這些基因一致上調，又以中晚期氣陰陽虛證為甚。其中免疫相關基因中晚期明顯上調，可能與荷瘤小鼠在長期的下丘腦過度活動后組織的損傷和修復有關，而神經發育及信號傳遞、蛋白合成及轉輸相關基因的上調，仍可能提示與神經中樞調節器官下丘腦功能活躍有關。

3.4 荷瘤小鼠下丘腦一致下調的基因

表4顯示，荷瘤小鼠下丘腦一致下調的基因較少僅 3個，LOC675606的功能不清楚。小鼠的Hrsp12主要在肝臟和腎臟中表達，在肺和腦部也有表達，它是一種核糖核酸內切酶，可切斷單鏈mRNA中的磷酸二酯鍵來抑制蛋白的翻譯。

Acta2所編碼的蛋白是高保守蛋白actins的一員，為構成細胞骨架的成分，在真核細胞中均有這些蛋白的表達。

表4 荷瘤小鼠下丘腦一致下調的基因(芯片讀數計算值)

腫瘤發生后，Hrsp12在下丘腦的表達一致下調，這與以上一致上調的基因中含有較多促進基因轉錄和翻譯功能是相一致的，進一步表明荷瘤小鼠下丘腦細胞內基因的轉錄和翻譯活躍。同時結合上調基因中含有較多與炎癥功能相關的基因，Acta2的一致下調可進一步說明，荷瘤小鼠下丘腦內細胞的正常架構可能受到了影響。

4 討論

中醫學辨證論治注重同病異證、異病同證。辨證結果顯示，荷瘤小鼠存在典型的同病異證現象，那么出現這種現象的物質基礎是什么呢?有研究顯示，中醫的證候尤其是虛證，其與下丘腦-垂體-內分泌軸的功能異常密切相關，下丘腦正是這些功能軸的中樞部分，在調節機體各項功能方面可能發揮舉足輕重的作用。本文報道了荷瘤小鼠不同證候下丘腦一致上調或下調的基因，觀察腫瘤小鼠下丘腦基因表達變化的共性。

值得注意的是，在本輪實驗荷瘤小鼠早期的2個證候中，氣虛證的基因表達往往大于邪毒壅盛證，似乎氣虛證下丘腦活動更為活躍。為什么會發生這樣的改變，其意義如何值得深入研究。

以往限于研究手段，對下丘腦的研究以形態學居多，信息量少，難以充分展現下丘腦病理特征。因而本研究采用先進的 Affymetrix“GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array”，該芯片同步觀察16661個核心基因和大量的外顯子剪接信息，能較好地反映荷瘤小鼠不同證候下丘腦復雜的基因表達特征。我們分別把同證候的16只小鼠下丘腦樣本合并檢測，因而其結果反映了小鼠下丘腦不同階段基因表達量的明顯變化。

荷瘤小鼠不同證候下丘腦差異表達的基因可能與腫瘤的發生有關，且有證候特征性，一些基因的一致高表達可能代表了這些證候的本質。

通過文獻檢索可以看到，學術界以往對這些基因的研究有較多基因與腦部功能有關，雖未直接點到下丘腦，但其應包括在腦部之內。這些基因涉及的功能如神經發育和信息傳遞等均與下丘腦自身功能密切相關。

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