酶聯免疫斑點試驗檢測技術在血液病合并痰涂片抗酸桿菌陰性結核病診斷中的應用

葉麗萍, 梁 艷, 施 兵, 劉麗輝, 金建剛, 張玉珠, 胡文清, 劉明娟,陽幼榮, 陳 虎, 吳雪瓊

2.全軍結核病研究所;

3.軍事醫學科學院附屬醫院造血干細胞移植中心。

結核分枝桿菌是一種細胞內寄生菌,抗結核免疫主要是細胞免疫,由于血液病患者自身免疫功能低下,應用化療或免疫抑制劑治療導致骨髓抑制,使機體免疫功能進一步下降,易合并各種感染,特別是結核分枝桿菌感染。血液病患者患結核病時的臨床癥狀不典型,而傳統的診斷結核病的檢測方法,大多數呈陰性反應,使醫師憑經驗給予診斷性抗結核治療,可能給患者增加了藥物不良反應的風險。近年來國內、外用酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)檢測免疫功能低下患者合并活動性結核,有很好的敏感性及特異性[1-4]。因此,近2年來我們用全軍結核病研究所研制的ELISPOT試劑盒,通過檢測外周血中分泌IFN-γ的單個核淋巴細胞,以傳統的診斷方法為對照對我科2006年6月—2008年10月間住院的415例血液病患者,其中105例發熱痰涂片抗酸桿菌陰性懷疑合并活動性結核的患者,進行了檢測,并對105例中臨床確診的24例結核患者及27例排除結核的患者共51例的臨床資料進行了回顧性分析,現報道如下。

材料與方法

一、觀察對象

檢測了105例發熱痰涂片抗酸桿菌陰性懷疑合并活動性結核的患者,非血液病、臨床及檢驗結果不全、中性粒細胞低(＜1.0×109/L)或血標本有凝塊、操作失誤等因素排除后,分析了51例。確診血液病[5]合并活動性結核[6]的患者24例,其中男16例、女8例,中位年齡40歲(11～70歲),有結核病史的9例,1例急性白血病患兒有結核病密切接觸史;24例中惡性血液病17例,其中急性白血病12例[急性髓細胞白血病(AM L)5例中3例M2型、2例M4型,急性淋巴細胞白血病(ALL)5例,混合型2例,其中各含1例AML-M2型同胞移植后4年及PH+ALL無關供者移植后2個月發生結核病]、慢性髓細胞白血病(CML)急變1例、骨髓增生異常綜合征(MDS)1例、淋巴瘤(NHL)2例(1例彌漫大B細胞型Ⅲ期B、1例免疫母T細胞型Ⅳ期)、1例多發性骨髓瘤(MM)IgG型Ⅲ期A;良性血液病例7例其中骨髓纖維化1例、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)3例(糖皮質激素治療3年與5年各發生1例)、再生障礙性貧血(AA)2例(含1例異基因移植后29 d)、1例系統性紅斑狼瘡(13年溶血性貧血史長期服糖皮質激素)(見表1)。27例排除活動性結核的患者：男19例、女8例,中位年齡40歲(14～77歲),3例有結核病史,惡性血液病22例(2例有呼吸衰竭)：急性白血病 9例、CML5例(移植后 2例)、2例 MDS、NHL1例、MM 4例、慢性淋巴細胞白血病(CLL)1例;良性血液病5例：純紅細胞再生障礙性貧血及貧血各2例、Castleman病1例。

表1 24例血液病合并結核病患者一般情況Table 1.General clinical data of the 24 patients with hematologic diseases and tuberculosis

二 、方法

(一)ELISPOT 取3～4 mL外周抗凝血,用淋巴細胞分層液分離、提純外周血單個核細胞(PBMC),調節細胞濃度至2.0×106/L。取一預包被IFN-γ捕獲單克隆抗體的微孔板,每個測試樣本需要微孔板3孔：陰性對照孔內加入完全細胞培養液50 μ L,陽性對照孔內加入陽性對照 PHA 50 μ L;在測試孔內分別加入CFP10-ESAT6融合蛋白50 μ L。分別在上述各孔內加100 μ L含有 2×105個PBMC的懸液,將微量板置于37℃含5%CO2孵箱中孵育20 h;棄上清液,用200 μ L ×PBS 洗板4次,每孔加入50 μ L 1∶60稀釋的IFN-γ檢測抗體,37℃孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L 1∶1 000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶,室溫孵育2 h;洗板后,每孔加入50 μ L新鮮配制的 BICP/NBT底物,顯色 15 min;可見板底顯示紫色斑點,用蒸餾水洗板中止反應。每1個點代表1個分泌IFN γ的T細胞,應用CTL公司酶聯斑點分析儀計數著色的斑點。當陰性對照孔點數＜8,檢測孔點數減去陰性對照孔點數≥8,可判斷所檢測標本為陽性;如果陰性對照孔點數≥8,檢測孔點數為陰性對照孔2倍,可判斷所檢測標本為陽性。

(二)結核菌素皮膚試驗 左前臂1/3處內側皮內注射0.1 mL(5 u)的結核菌素純蛋白衍生物(PPD),出現皮丘注射成功,72 h后測量紅腫或硬結橫縱直徑(mm),其平均值作為PPD皮試大小。若硬結的橫徑及縱徑的平均數≥5 mm為陽性。

(三)抗結核抗體檢測 取外周不抗凝血2～3 mL,1～2 h后3 000 r/min離心15 min,取上清液用于抗結核抗體檢測。聯合檢測3個抗結核抗體,所用抗原分別為阿拉伯甘露聚糖、結核分枝桿菌活動期產生的38×103u蛋白及16×103u蛋白。嚴格按試劑盒提供的步驟操作。檢測的血或(和)痰及體液標本≥2項陽性為檢測陽性。

(四)活動性結核的診斷標準

1.肺結核：按中華醫學會結核病學分會制定的肺結核診斷和治療指南診斷[6]。

2.肺外結核：①慢性中毒癥狀有發熱、盜汗、消瘦;②PPD試驗強陽性或血抗結核抗體≥2項陽性;③體液沉渣涂片抗酸桿菌陽性或結核桿菌培養陽性或抗結核抗體≥2項陽性;④影像學檢查具有結核的特點;⑤組織活檢病理證實;⑥試驗性抗結核治療有效。凡符合上述≥3項者診斷為肺外結核。

三、統計學方法

數據分析采用t檢驗;多變量間的相關性用logistic回歸軟件進行相關性分析。

結 果

一、血液病合并活動性結核的患者結核相關試驗結果

臨床確診24例合并活動性結核患者中：PPD陽性6例、陰性5例(用免疫抑制劑13例未查);抗結核抗體檢測陽性9例、陰性15例;ELISPOT陽性14例(未查3例)、陰性5例(其中2例淋巴細胞數＜0.5×109/L)(見表2)。PPD陰性的 3例中ELISPOT均陽性,1例 ELISPOT陰性而 PPD陽性;3例ELISPOT陰性患者中抗結核抗體均陽性(2例為淋巴細胞數低);9例抗結核抗體陰性患者中,ELISPOT試驗均陽性。

二、血液病排除活動性結核患者其結核的相關試驗結果

27例(23/27肺部感染占85.2%)中PPD陰性11例、陽性1例(用免疫抑制劑15例未查);抗結核抗體陰性21例、陽性3例(未查3例);ELISPOT陰性24例、陽性3例(見表2)。ELISPOT假陽性率11.1%,PPD 8.3%及抗結核抗體12.5%,三者差異無統計學意義(見表3);3項均陽性或任意2項陽性的患者均為0。1例PPD陽性患者抗結核抗體及ELISPOT均陰性,3例抗結核抗體陽性患者中2例ELISPOT均陰性,3例ELISPOT試驗陽性患者中2例抗結核抗體均陰性。

三、ELISPOT靈敏度、準確度評價

ELISPOT的靈敏度(73.6%,14/19)高于抗結核抗體試驗(37.5%,P=0.0047)和PPD皮膚試驗(54.5%,P=0.0351);ELISPOT的準確度(82.6%,38/46)高于抗結核抗體(62.5%,P=0.0447)和PPD皮膚試驗(77.8%)(見表3)。

四、ELISPOT的特異度、陽性預測值和陰性預測值評價

ELISPOT的特異度(88.9%)與抗結核抗體(87.5%)及 PPD(93.8%)相似;陽性預測值(82.4%,14/17)略高于抗結核抗體(75.0%,9/12),與PPD(85.7%)相似;以上差異均無統計學意義。陰性預測值82.76%,高于抗結核抗體 58.3%(P=0.0421)差異有統計學意義,略高于PPD 75.0%(見表3)。

五、血液病懷疑活動性結核診斷進行logistic回歸相關性分析

表2 血液病合并結核病24例及27例排除結核病患者的ELISPOT、抗結核抗體與PPD試驗Table 2.The diagnostic results of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in hematologic patients with(24)or without(27)tuberculosis

表3 血液病合并結核患者ELISPOT、抗結核抗體與PPD試驗結果比較Table 3.Utility of ELISPOT,PPD and anti-TB antibodies in patients with both hematologic diseases and tuberculosis

對51例患者性別、年齡、結核病史或接觸史、熱型、影像學、血象(特別是淋巴細胞計數)、紅細胞沉降率、C反應蛋白、抗結核抗體、ELISPOT、PPD試驗、B超及影像學等多因素分析后發現,活動性結核只與ELISPOT、PPD、抗結核抗體、肺CT、結核史 5項相關(見表4)。

表4 對51例血液病懷疑結核診斷數據進行logistic回歸相關性分析Table 4.Logistic regression analysis of the factors associated with the tuberculosis in 51 patients with hematologic diseases

討 論

急性白血病合并結核患病率報道不一,在1.2%～20%以上不等[7]。我國人群中活動性肺結核發病率為367/10萬[8],本研究血液病合并活動性結核發生率為24/415(5.7%),約為該發病率的15.5倍,與嚴云等[9]報道5%相近。24例合并結核病患者中有結核病史9例占37.5%,另有1例為密切接觸者。24例中惡性血液病17例占70.83%,初診時發病7例,治療后10例,其中2例造血干細胞移植后發病、1例CML加速期發病。17例中肺結核8例,肺外結核9例(累積胸膜8例、心包1例,≥2部位6例)。24例中良性血液病 7例,占29.16%,有 6例長期使用免疫抑制藥物(糖皮質激素或CSA、1例為sAA造血干細胞移植后早期發生)、1例初診時合并。發生肺結核2例、肺外結核5例,均為結核性胸膜炎。良、惡性血液病肺外結核均＞50%。

在27例血液病排除活動性結核的患者中,肺部感染占85.2%(3例有結核病史),病理檢查后排除8例,試驗性抗結核治療結合相關試驗后排除9例,抗感染治療(細菌、真菌、病毒)后好轉排除其余患者。

由于我組24例患者均為痰涂片抗酸桿菌陰性結核,沒有典型的結核病癥狀,以結核性胸膜炎為主。因自身免疫功能低下,大部分患者長期用免疫抑制劑,PPD試驗陰性占多數,同時合并其他感染(細菌、真菌、病毒)10/24(41.66%),患者的全血細胞減少又造成取病理難,不能依據結核病診斷標準確診(痰涂或培養陽性及病理診斷),使誤診率較高。從本研究結果中就可看出常用的PPD試驗(13例用免疫抑制劑而未查)與抗結核抗體試驗在此類患者中陽性率低,而ELISPOT較上述2項試驗陽性檢出率高。

Mahairas等[10]在1996年發現的一段存在結核分枝桿菌中名為“RD1”的基因序列,而在卡介苗菌株和大部分環境中的分枝桿菌基因中則缺乏RD1序列;RD1編碼產生2種蛋白：ESTA-6和CFP-10,這2種蛋白作為特異性抗原刺激機體特異性 T細胞產生IFN-γ。

本研究結果進一步證實了血液病痰涂片抗酸桿菌陰性患者的活動性結核診斷困難,特別是結核相關試驗陽性率低;而ELISPOT作為一種新的檢測結核的酶免疫學方法,其靈敏度與準確度顯著高于傳統的試驗方法,試驗需時少(2 d)、對隱性活動性結核有診斷價值,可排除因接種卡介苗PPD試驗陽性的非活動性結核感染的人群;但受淋巴細胞計數及操作者技能等因素的影響。如果ELISPOT與抗結核抗體、PPD試驗相聯合,可明顯提高此類患者結核的診斷率79.2%,臨床醫師仍需結合影像學、結核病史及抗結核治療療效綜合判斷,可使診斷率提高(≥90%)。總之,ELISPOT是血液病患者合并活動性結核的重要輔助診斷手段。

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