甘肅小麥禾谷孢囊線蟲rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列特征及ITS-RFLP分析

葉文興, 徐秉良, 彭德良, 黃文坤

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院,蘭州 730070;2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae Wollenweber,1924,cereal cyst nematode,CCN)是溫帶禾谷類作物上的世界性重要病原線蟲,最早于1874年Kühn在德國發(fā)現(xiàn),隨后在英國、俄羅斯、挪威、澳大利亞、加拿大、日本、印度、美國、新西蘭、中國等40多個國家發(fā)生危害,嚴重影響禾谷類作物尤其是麥類作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。自1989年我國首次在湖北天門縣發(fā)現(xiàn)禾谷孢囊線蟲危害小麥后[1-2],目前已發(fā)現(xiàn)在河北、河南、北京、山西、內(nèi)蒙古、青海、湖北、安徽、山東等11省市都有CCN的分布,CCN已成為嚴重威脅我國小麥生產(chǎn)的主要病害[3-5]。

隨著分子診斷技術的快速發(fā)展,已探索出許多線蟲種群分類鑒定的分子診斷方法,利用分子技術探索不同種群 rDNA-ITS和 rDNA 28S的D2/D3區(qū)的序列特征已成為近年來線蟲分子診斷的研究熱點。28S是核糖體大亞基rRNA的轉(zhuǎn)錄基因,28S的D2/D3區(qū)是 rDNA中進化最快的一個編碼區(qū),具有高度保守的序列將其分割,能夠在種的水平上進行種間的分子鑒別[6]。Subbotin等[7]從28S rDNA-D2/D3區(qū)分析了墊刃目(Ty lenchida)線蟲在亞目、科、種系統(tǒng)發(fā)育中與其他種群的親緣關系。李佳等[8]對香蕉穿孔線蟲 rRNA基因的D2/D3區(qū)序列進行了分析,蔣立琴等[9]也成功地利用 28S rDNA-D2/D3區(qū)特征將傘滑刃線蟲屬部分種群進行區(qū)分,所以,D2/D 3區(qū)常常用于研究不同地理來源的不同線蟲種間的遺傳多樣性[10]。同樣,rDNA-ITS區(qū)序列和 ITS-PCR-RLFP圖譜也能夠有效地區(qū)分和鑒別線蟲種間的親緣關系和遺傳特征。ITS序列是一個多用途的遺傳標記,位于18S和28S核糖體DNA基因的重復簇之間,中間被5.8S核糖體DNA基因分開[11]。Subbotin等[12]擴增了5種孢嚢線蟲rDNA的28S基因的D3擴展區(qū)和ITS1-5.8S-ITS2區(qū),結(jié)果發(fā)現(xiàn) G.rostochiensis和G.pallida D3擴展區(qū)的核苷酸序列相同,并用RFLP分析成功區(qū)分了來自南美茄科植物上的3種孢嚢線蟲 G.rostochiensis、G.tabacum、G.pallida和1個未描述的種,同時構(gòu)建了遺傳上親緣關系的系統(tǒng)發(fā)育樹。Ferris等[13]分析來自俄國H.filip jevi群體的rDNA-ITS序列,證實俄國不同地區(qū)的 H.filip jevi基因一致,與瑞典的 H.avenae相似性達到99.7%,支持了瑞典的H.filip jevi和 H.avenae是近緣種,同時也提示形態(tài)相似,地理隔離的群體有可能是同屬種。在RFLP圖譜分析中,有時限制性片段長度的總和大于沒有酶切的陽性對照擴增產(chǎn)物,這說明禾谷孢囊線蟲群體的ITS區(qū)域存在異質(zhì)性[14]。Subbotin等[15]對來自世界多個國家和地區(qū)的禾谷孢囊線蟲群體 rDNA中ITS區(qū)的PCR-RFLP分析,發(fā)現(xiàn)了ITS有異質(zhì)性,命名為 ITS“A”型和 ITS“B”型。鄭經(jīng)武等[16]對來自山西太谷的禾谷孢囊線蟲群體與國外上述兩種ITS型群體rDNA中ITS區(qū)的PCR-RFLP比較分析,發(fā)現(xiàn)中國禾谷孢囊群體的ITS特征系是一個新的類型“C”型,用 H in fI和 Tru9 I可將中國禾谷孢囊線蟲與其他禾谷孢囊線蟲分開。彭德良等[17]用 H in fⅠ、AluⅠ和 RsaⅠ將中國禾谷孢囊線蟲和摩洛哥禾谷孢囊線蟲群體存在差異,AvaⅠ和H in dⅢ2種限制性內(nèi)切酶不能酶切禾谷孢囊線蟲的ITS產(chǎn)物。

本研究應用PCR技術對采自甘肅6個市縣的7個禾谷孢囊線蟲群體和1個河南群體、1個安徽群體的28S rDNA-D2/D3區(qū)和ITS區(qū)進行了序列特征分析,并對甘肅禾谷孢囊線蟲 ITS區(qū)進行了RLFP圖譜分析,以揭示甘肅省內(nèi)不同地理種群間的親緣關系。

1 材料與方法

1.1 禾谷孢囊線蟲孢囊的分離方法

在2009年2月和 6月,從甘肅省文縣、天水、甘谷、榆中、武威、民勤以及河南省安陽縣和安徽省蚌埠市等8個縣市(表1)采集受害的小麥根及根際土壤,取200 g土壤在小桶容器中使土塊分散,用強水流沖洗,用木棍攪動,沉淀片刻后,將水溶液通過20目和60目的樣品篩,重復以上步驟3次,用小水流輕輕清洗60目篩殘余物,將其60目篩中殘余物淋洗到三角瓶中,用濾紙過濾,在解剖鏡下挑取飽滿可育的孢囊冷藏備用[17]。

1.2 禾谷孢嚢線蟲DNA的提取

挑取1個飽滿的孢囊,放入滅菌的Eppendorf管中,加入14μL滅菌的重蒸水,在液氮中速凍1min取出。用75%乙醇消毒的玻璃棒在Eppendorf管中轉(zhuǎn)動至冰融化,使孢囊破碎研磨1 min后加入3μL的10×PCR buffer(Promega,USA)和3μL蛋白酶 K溶液(600mg/ML)(TaKaRa,Biotech),然后在-20℃下冷凍至少2 h。之后,將Eppendorf管從冰箱中取出,置65℃下溫育1.5 h;接著在95℃10min,使蛋白酶K變性,最后12 000 r/min下離心1 min,取上清DNA懸浮液于-20℃保存?zhèn)溆肹17]。

表1 禾谷孢嚢線蟲采樣及注冊的ITS和D2/D3序列

1.3 28S rDNA D2/D3區(qū)域PCR擴增

本研究采用 50μL的 PCR反應體系,10×PCR-buffer(含 Mg2+)5.0 μL,dNTPs 4 μL,引物D2A 1.5μL,引物 D3B 1.5μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4μL,模板DNA 5.0 μL,滅菌重蒸水補足到50μL,同時設置無DNA模板的陰性對照。試驗所用的引物為 D2A(ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG)和D3B(TCGGAAGGAACCAGCTACTA)[18-20]。在 Eppendorf PCR擴增儀上進行擴增。PCR擴增的反應條件為：94℃預變性4Min,94℃30s,55℃45s,72℃2 min,循環(huán)35次,72℃延伸10 min后保存在4℃條件下。取5μL擴增產(chǎn)物加1μL 6×Loading buffer在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用0.5×TAE作為電泳緩沖液,100 V下電泳45 Min,用EB染色,用BIO-RAD成像儀在紫光燈下觀測并照相。

1.4 28S rDNA D2/D3區(qū)域PCR產(chǎn)物的克隆、測序和序列分析

將PCR產(chǎn)物進行回收純化,純化后的產(chǎn)物與pGEM-T easy vector連接12 h,然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞DH 5a中,用熱擊法進行轉(zhuǎn)化后涂在含有Ampicillin(100 Mg/L)、IPTG(24 mg/L)和 X-gal(200mg/L)的 LB培養(yǎng)基平板上,涂勻后倒置入37℃培養(yǎng)箱中12～16 h,進行藍白斑篩選。挑取單個白斑于含有Ampicillin(100 mg/L)的液體 LB中搖培過夜,經(jīng)菌落PCR鑒定后,將含有正確片段的菌液進行測序。所得序列用 Chromas、DNAMAN分析比對,在GenBank注冊,并在NCBI下載已知近緣種序列,用MEGA 4.0中的UPGMA法構(gòu)建禾谷孢囊線蟲群體的系統(tǒng)發(fā)育樹,進行親緣關系分析。

1.5 rDNA-ITS的PCR擴增

本研究采用 50μL的PCR反應體系,10×PCR-buffer(含 Mg2+)5.0 μL,dNTPs 4 μL,引物TW 81 0.3μL,引物 AB28 0.3μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.4μL,模板DNA 3.0 μL,滅菌重蒸水補足到50μL,同時設置無DNA模板的陰性對照。試驗所用的引物為 TW 81(GTTTCCGTAGGTGAACCTGC)和AB28(A TATGCTTAAGTTCAGCGGGT)[21]。在Eppendorf PCR擴增儀上進行擴增。PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5Min,94℃45s,55℃1 min,72℃2Min,循環(huán)35次,72℃延伸10 min后保存在4℃條件下。取5μL擴增產(chǎn)物加1μL 6×Loading bu ffer在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用 0.5×TAE作為電泳緩沖液,100 V下電泳45Min,用EB染色,用BIO-RAD成像儀在紫光燈下觀測并照相。

1.6 ITS的PCR擴增產(chǎn)物的克隆、測序和序列分析

PCR產(chǎn)物的回收純化、連接、轉(zhuǎn)化、測序等方法與上述方法相同,所得序列在GenBank注冊,并在NCBI下載已知近緣種序列,用 MEGA 4.0進行UPGMA聚類分析。

1.7 ITS-RFLP分析

分別取5μL純化后的PCR產(chǎn)物用9種限制性內(nèi)切酶 AluⅠ 、AvaⅠ 、Bsh1236Ⅰ 、Bsu RⅠ 、C foⅠ 、Hin fⅠ、RsaⅠ、TaqⅠ和 MvaⅠ酶切。AluⅠ 、AvaⅠ、Bsh1236 Ⅰ、Bsu R Ⅰ、C fo Ⅰ 、H in fⅠ 、Rsa Ⅰ、MvaⅠ在37℃水浴中16 h,Taq I在65℃水浴16 h。酶切后的DNA加1μL 10×Loading buffer在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用0.5×TAE作為電泳緩沖液,90 V下電泳1.5 h,用EB染色,用BIORAD成像儀在紫外光下觀測和照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 28S rDNA D2/D3區(qū)域和rDNA-ITS的PCR擴增結(jié)果

經(jīng)PCR擴增的禾谷孢嚢線蟲28S rDNA的D2/D3區(qū)和ITS區(qū)序列,擴增片段長度分別約為780 bp(圖1)和1 040 bp(圖2)。序列測定結(jié)果表明,GsWx、GsMq、GsTs1、HnAy1、GsYz、AhBb、GsTs2 7個禾谷孢囊線蟲群體的D2/D3區(qū)的序列長度為782 bp,G sGg、G sWw 2個禾谷孢囊線蟲群體D2/D3區(qū)序列長度為784 bp;這9個禾谷孢囊線蟲的ITS區(qū)的序列長度都是1 045 bp,將所測的禾谷孢囊線蟲D2/D3區(qū)和 ITS區(qū)序列在GenBank上注冊,得到了9個序列注冊號(表1)。

圖1 9個禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)28S rDNA-D2/D3區(qū)擴增產(chǎn)物

圖2 9個禾谷孢囊線蟲(Heteroderaavenae)rDNA-ITS擴增產(chǎn)物

2.2 序列分析結(jié)果

2.2.1 28S rDNA-D2/D3區(qū)序列分析和聚類分析

用DNAMAN軟件對比這9個禾谷孢囊線蟲的D2/D3區(qū)的序列,其序列的一致性達99.77%,其中GsGg與GsWw種群的序列沒有差異,比其他7個群體的序列在第136、137兩個位點插入2個堿基(T和C);GsTs1群體在第284位點、GsYz群體的第331位點有堿基的替換 ;G sW x、GsWq、GsTs2、A h-Bb1、HnAy1 5個群體的序列無差異。這表明在甘肅禾谷孢囊線蟲群體間D2/D3區(qū)的一致性很高、具有很高的保守性。

通過NCBI中的BLAST比對分析,將本研究中所涉及的9個禾谷孢囊線蟲群體的D2/D3序列與GenBank中下載的孢囊屬(Heterodera)、球形孢囊屬(Globodera)、棘皮屬(Cactodera)的13個群體的D2/D3序列進行比對分析,用UPGMA方法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。從圖3中可以看出,在遺傳距離為0.02的水平上,可分為3類：第1類有GsW x、GsMq、G sTs1、H nAy1、GsYz、AhBb1 、G sTs2、Gs-Gg、GsWw 、新西蘭的 H.auck landica(DQ328688)和 H.litoralis(DQ328691)、敘利亞的H.latipons(DQ328687)、印度的 H.sorghi(DQ328689)、比利時的 H.salixophila(DQ328690)、美國的 H.glycines(DQ328692)15個群體,其中7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體與 HnAy1、A hBb1、新西蘭的 H.aucklandica(DQ328688)為同一組群,遺傳距離很小,并且與敘利亞的H.latipons(DQ328687)有著96%的置信度;第2類有德國的C.cacti(DQ328702)、波蘭的G.pallida(EU855119)和G.rostochiensis(EU-855120)、荷蘭的 G.pa llida(AY 592992)、美國的G.tabacum(GQ294492)5個群體,棘皮屬和球形孢囊屬的遺傳距離比較接近;第3類有比利時的H.urticae(DQ328696)、德國的 H.goetting iana(DQ-328697)2個群體,這2個群體之間的遺傳距離小于0.01,置信度在100%。D2D3區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹表明孢囊屬、球形孢囊屬、棘皮屬之間有著較近的遺傳關系,在孢囊屬有兩個大的分支,這些遺傳特征之間的差異與寄主有著密切的關系,孢囊屬在禾谷類寄主和豆科類寄主就存在明顯差異,不同寄主間有小種的分化,但在不同屬之間又有著近緣關系。

圖3 用UPGM方法構(gòu)建的28S rDNA-D2/D3區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 rDNA-ITS區(qū)序列分析和聚類分析

用DNAMAN比對后的結(jié)果為：禾谷孢囊線蟲rDNA-ITS區(qū)僅在第620和第897位點有堿基替換,序列的一致性達99.9%。在NCBI上用BLAST比對分析后,在GenBank下載與本研究9個禾谷孢囊線蟲有近緣關系的16個群體,包括Avenae組的有效種有澳大利亞的 H.australis(AY148395)、中國(AY 148382)、法國(AY 148374)、德國(AY148360)、以色列(AY 148366)、印度(AF274397)的 H.avenae、德國的 H.Mani(AY148377)和 H.p ratensis(AY 148383)、美國的 H.filip jevi(GU 079654)、英國的H.arenaria(AF274396);Schachtii組有伊朗的 H.glycines(AF498387)、比利時的 H.schachtii(AY 166438);Goettingiana組的有德國的H.goettingiana(AF274414)、荷 蘭的 H.cruciferae(AF274411)、意大利的 H.carotae(AY 347917);還有比利時的H.urticae(AF274412)。用MEGA 4.0的UPGMA方法構(gòu)建ITS區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹,其遺傳距離為0.05(圖4)。在圖4中,本研究的9個禾谷孢囊線蟲群體和在GenBank下載的16個孢囊線蟲群體可分為3類：本研究中的9個禾谷孢囊線蟲群體與上述Avenae組的10個群體為一類,這19個群體間的遺傳距離很小,除美國的 H.filip jevi(GU 079654)群體外,其余18個群體很接近,其中澳大利亞的H.australis(AY148395)群體與中國通州的H.avenae(AY148382)和本研究的9個群體可分為同一組群;很明顯,伊朗的 H.glycines(AF498387)、比利時的H.schachtii(AY166438)為一類,其置信度為100;Goettingiana組3個群體和比利時的 H.urticae(AF27-4412)為一類。這3類群體中,Avenae組與其余2類群體存在明顯的異質(zhì)性,在同寄主群體間存在地域和寄主對群體分化的影響。

2.3 ITS-RFLP分析

用9種限制性內(nèi)切酶酶切7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體的rDNA-ITS擴增產(chǎn)物后,共產(chǎn)生22個清晰可見的酶切片段(圖5)。用 AluⅠ酶切7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體的rDNA-ITS擴增產(chǎn)物,均產(chǎn)生2個相同的560 bp和480 bp RFLP片段(圖5a);C foⅠ酶切后,7個群體均產(chǎn)生相同的3個 750、160、110 bp的 RFLP 片段(圖 5b);Bsh1236Ⅰ酶切后產(chǎn)生900 bp和140 bp的2個片段分布都相同(圖5c);AvaⅠ不能酶切這7個甘肅禾谷孢囊線蟲的rDNA-ITS產(chǎn)物(圖5d);RsaⅠ酶酶切后產(chǎn)生相同的2個720 bp和320 bp的片段(圖5e);Bsu RⅠ酶切片段產(chǎn)生的3個RFLP分布圖均相同,片段為 480、380 bp和180 bp(圖 5f);H in fⅠ酶切產(chǎn)生 2個相同的860 bp和180 bp的片段,由于酶切效率低,有未切完全的殘留片段(1 040 bp)(圖5g);MvaⅠ酶切后產(chǎn)生的3個片段也相同,分別是420、330 bp和290 bp(圖5h);TaqⅠ產(chǎn)生4個均相同的400、280、140 bp和 130 bp的 RFLP片段(圖 5i)。

圖4 用UPGM方法構(gòu)建的rDNA-ITS區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 用9種酶酶切7個甘肅禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)群體

3 結(jié)論與討論

本研究通過對7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體和HnAy1、AhBb1群體的28S rDNA-D2/D3區(qū)的序列特征分析發(fā)現(xiàn),7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體和HnAy1、AhBb1群體的28S rDNA-D2/D3區(qū)都具有相同的保守性,在序列特征上只有2個堿基的插入(GsGg、GsWw)和 2個位點的堿基替換,序列差異很小,序列的一致性達99.8%。構(gòu)建的28S rDNAD2/D3區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹將 GsWx、GsMq、GsTs1、HnAy1 、GsYz、AhBb1 、GsTs2 、GsGg 、GsWw 9 個群體歸為同一分支,同新西蘭的 H.auck landica(DQ328688)有著很近的親緣關系。

分析rDNA-ITS區(qū)的序列和RFLP圖譜,對孢囊線蟲種的鑒定和近緣種辨別有著重要的意義。Subbotin等[22]研究了70個H.avenae復合種群的ITS序列和RFLP圖譜,構(gòu)建了H.avenae復合種群的系統(tǒng)關系,揭示出H.avenae是一個并系分類群,中國禾谷孢囊線蟲不同于其他的 H.avenae群體。本研究中的 GsW x、GsMq、GsTs1、HnAy1、GsYz、AhBb1、GsTs2、GsGg、GsWw 9 個群體與澳大利亞的 H.australis(AY 148395)、中國的 H.avenae(AY 148382)為同一分支(圖4),與歐洲和印度的H.avenae或A venae復合種群的其他群體相比較,其遺傳距離最為接近。所以,可以在分子水平上診斷出7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體都在A venae組,且與美國的H.filip jevi(GU079654)有明顯的差異。同時,在種群的分化上存在地域差異的影響,ITS-RFLP圖譜分析可以直觀地鑒別種內(nèi)和種間的異質(zhì)性,有利于群體間的遺傳多態(tài)性的研究。Subbotin等[15]從禾谷孢囊線蟲群體中的ITS檢測到的兩種不同的單元型,稱之為“A 型”和“B型”,“A 型”不能被 AluⅠ和RsaⅠ這兩種酶酶切,而“B型”能被A luⅠ酶切成2個片段(560 bp和500 bp),被RsaⅠ酶切產(chǎn)生720、320 bp 2個片段,因此,AluⅠ和RsaⅠ是區(qū)分禾谷孢囊線蟲“A型”和“B型”這兩單元型的主要限制性內(nèi)切酶[23],并且在歐洲禾谷孢囊線蟲群體中以ITS“A型”為典型,而在印度禾谷孢囊線蟲中是以“B型”為典型的。Zheng等[16]發(fā)現(xiàn) H in fⅠ酶切中國禾谷孢囊線蟲群體后產(chǎn)生的圖譜與“A型”和“B型”存在異質(zhì)性,將其劃分為“C型”,AvaⅠ則不能酶切禾谷孢囊線蟲群體。用Bsu RⅠ、TaqⅠ可把 H.avenae和H.filip jevi群體分離出[15],C foⅠ可以將H.ciceri與其他群體分開,MvaⅠ和Bsh1236Ⅰ可以把 H.hordecalis分離出來。本研究的ITS-RFLP結(jié)果表明,7個甘肅禾谷孢囊線蟲群體均能被 A luⅠ、RsaⅠ和H in fⅠ酶切,并且酶切結(jié)果與H.avenae“C型”完全一致。本文中的9種酶切結(jié)果與所知文獻完全相符[15-23]。綜上所述,甘肅的這7個禾谷孢囊線蟲群體應為禾谷孢囊線蟲(H.avenae),ITS-RFLP的圖譜特征應為“C型”。

通過對9種禾谷孢囊線蟲的28S rDNA-D2/D3區(qū)和ITS區(qū)序列以及ITS-RFLP分布型的比較分析,反映了禾谷孢囊線蟲種群間和種群內(nèi)的遺傳學關系。甘肅禾谷孢囊線蟲種群內(nèi)的遺傳距離很小,雖然在個別群體(GsGg、GsWw)上有幾個堿基的插入或替換,這并不能影響種群內(nèi)部歸類分析,因為根據(jù)rDNA基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹僅僅是一個基因樹,和物種樹可能還存在差別[9]。基因的分化時間可能早于物種的分化時間,基因樹的拓撲結(jié)構(gòu)可能不同于物種樹。因此,把傳統(tǒng)的形態(tài)分類特征、28S rDNA-D2/D3區(qū)和ITS區(qū)以及 RFLP圖譜特征相結(jié)合,對于禾谷孢囊線蟲的分類鑒定會更加有效。利用28S rDNA-D2/D3區(qū)的保守性和ITS區(qū)的穩(wěn)定性,在相關的區(qū)段設計特異性引物進行PCR擴增,可用于禾谷孢囊線蟲的檢疫、分類鑒定和系統(tǒng)學研究中的特異性分子檢測。

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