Eca109細胞光動力損傷效應的傅里葉變換紅外光譜分析*

劉婉華，劉 健，刁振琦，李云濤，唐偉躍

1)鄭州大學物理工程學院鄭州450001 2)鄭州大學信息工程學院鄭州450001

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是光敏劑進入人體后，有選擇地聚集在腫瘤組織上，經特定波長激光激發，在腫瘤組織內發生一系列的光化學反應，產生多種活性氧物質，如單線態氧、超氧陰離子及羥自由基等，作用于生物分子中的氧化敏感基團，導致其氧化失活，從而對蛋白質、核酸和脂類生物大分子產生破壞作用，使細胞的結構和功能受到嚴重影響，導致細胞凋亡或壞死，達到治療腫瘤的目的。但是目前對PDT殺傷腫瘤細胞的作用機制還未完全認識。傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，FTIR)主要研究分子振動光譜和轉動光譜，其光譜強度可反映樣本生化組成的定量信息，而光譜頻率則反映樣本分子的空間結構、化學鍵等定性信息。FTIR的特點是掃描速度快，光通量大，分辨率高，信噪比高，測定光譜范圍寬，在分子生物學和臨床醫學研究領域有著廣泛的應用。作者用FTIR技術分析光敏劑血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)的光敏化作用對人食管癌細胞株Eca109生物大分子核酸、蛋白質及脂類的微觀結構的影響，從分子水平探討PDT對腫瘤細胞的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 HMME購自上海紅綠光敏劑研究所有限公司;Eca109購自中國科學院上海細胞生物學研究所;RPMI 1640培養液購自美國Gibco公司。美國Nicolet IR200傅里葉變換紅外光譜儀;德國CHRIST冰凍干燥機，型號ALPHA1-2LD;光敏劑激發光源半導體激光器，英國DIOMED公司，波長630 nm，輸出功率2 W。

1.2 Eca109細胞的PDT處理 Eca109于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中傳代、培養，取對數生長期的細胞用于實驗，制備密度為1×105mL－1的單細胞懸液，接種于培養板中，分組培養，每組3個復孔。PDT組:將培養板放入CO2培養箱中培養 24 h，待其貼壁后，加入 5 mg/L的HMME，繼續培養6 h，然后用半導體激光器垂直照射培養板，光劑量15 J/cm2，繼續培養6 h，收集細胞進行紅外光譜的采集。對照組不加光敏劑、不照射。

1.3 FTIR的采集及處理 將細胞制成溴化鉀壓片，放置于儀器中進行檢測。參數設定:光譜掃描范圍400 ～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描累加次數128次。所得光譜均用Nicolet公司的Omnic 5.0專用軟件處理。采用Origin 7.5軟件對蛋白質酰胺Ⅰ進行去卷積和二階導數處理，確定重疊峰子峰個數和峰位置，并對酰氨Ⅰ帶及其子峰進行曲線擬合，根據各子峰占整個酰胺Ⅰ帶面積的比例計算蛋白質各二級結構的含量。

2 結果與討論

2.1 光譜圖 Eca109特征峰歸屬見表1［1-3］。2組的紅外光譜圖見圖1。可以看出，2組光譜譜型、譜峰和位置都存在很大的差異。

表1 Eca109紅外光譜特征峰及歸屬

圖1 2組紅外光譜圖

2.2 蛋白質光動力損傷后的譜帶分析

2.2.1 蛋白質分子C-O(H)伸縮振動譜帶 1 161 cm－1是蛋白質C-O(H)鍵的伸縮振動譜帶，它主要來自蛋白質分子中的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基C-O(H)基團的伸縮振動，光動力損傷后峰值向低波數頻移到1 158 cm－1。分子中C-O(H)基團一般與其他基團或分子形成氫鍵，吸收波數的頻移說明C-O(H)受約束程度降低，氨基酸殘基的C-O(H)基團某些氫鍵斷裂，氫鍵體系發生變化［4］。對蛋白質來說，基團的損傷必然導致分子空間構象受到破壞，蛋白質變得松散。蛋白質側鏈基團的損傷主要受單線態氧作用，酪氨酸、色氨酸都含有芳香環，而單線態氧主要損傷芳香環［5］，此外單線態氧還可以作用于色氨酸的吲哚環［6］。

2.2.2 酰胺Ⅰ帶 酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm－1)常用來分析蛋白質的二級結構，它由代表羰基伸縮振動的幾個子帶組成，包含有α螺旋、β折疊、無規卷曲、β轉角等［7］，各組分的譜帶通常相互疊加在一起。圖2是結合去卷積、二階導數譜對原譜進行曲線擬合得到的譜圖。2組二級結構相對含量見表2。

圖2 酰胺Ⅰ帶二階導數譜

表2 2組蛋白質二級結構的指認［8］和平均相對百分含量值 %

可以看出，當Eca109細胞光動力損傷后，蛋白質的α螺旋含量減少12.4%，β折疊含量減少13.5%，表明蛋白質主鏈的有序結構減少。而無規卷曲和β轉角的含量分別上升49.6%和43.1%，提示蛋白質無序性增加，蛋白質主鏈構象趨于松散。主鏈構象發生變化的原因是光敏劑受激光照射后，產生的單線態氧具有較強的氧化性，破壞了形成α螺旋和β折疊的鏈內和鏈間氫鍵體系，α螺旋和β折疊展開，被卷曲在蛋白質分子內的色氨酸等疏水芳香族殘基趨向蛋白質表面［9］。說明光動力作用對Eca109細胞的蛋白質二級結構造成明顯損傷，蛋白質空間構象的改變使其失去活性，其結果影響細胞的結構和功能，從病理學損傷效應上表現為細胞凋亡和壞死。

2.3 核酸光敏損傷后的譜帶分析 FTIR光譜中，譜帶969 cm－1是細胞內磷酸化蛋白和核酸的磷酸單酯二價陰離子的對稱伸縮振動，反映細胞中核酸或磷酸化蛋白質的含量。磷酸二酯基團的對稱伸縮振動 νs(PO2－)譜帶峰位于 1 084 cm－1附近，反對稱伸縮振動νas(PO2－)譜帶對應于 1 244 cm－1。光動力損傷后969 cm－1峰變成了以975 cm－1為中心的一個寬峰，它對應于各種各樣的由于DNA鏈斷裂產生的多核苷酸。νs(PO2－)譜帶 1 084 cm－1峰向高波數移動，由二階導數譜可知它變成了由1 089、1 078及1 072 cm－1組成的一組小峰，峰值強度均大幅下降。νas()譜帶1 244 cm－1峰的吸收強度也有所下降。譜帶反映核酸骨架上磷酸二酯基團結構的變化，在完全無氫鍵時，磷酸二酯基團的反對稱伸縮振動在1 260 cm－1處，在完全氫鍵化后在 1 240 cm－1處［4］。1 244 cm－1峰向高波數移動，表明核酸骨架上磷酸二酯基團中形成氫鍵的程度減弱，氫鍵化程度的降低使細胞的核酸骨架從無序趨向于有序，細胞突變和異構化受抑。磷酸二酯基團的吸收帶峰值的頻移和強度減小，說明核酸分子的構象發生變化、含量降低，光動力損傷作用造成磷酸二酯基團的損傷，使 DNA單、雙鏈斷裂，癌細胞DNA復制能力被抑制，由此導致細胞凋亡。

2.4 脂質光敏損傷后的譜帶分析 1 740 cm－1峰反映了細胞膜磷脂中羰基C=O基團的伸縮振動，峰位向高波數移動，吸收峰強度減弱，表明磷脂的構象發生改變，碳氫鏈間相互作用增強［10］。譜帶2 858和2 873 cm－1峰屬于磷脂脂質中 CH2、CH3基團的對稱伸縮振動，而譜帶2 927和2 952 cm－1峰屬于CH2、CH3基團的反對稱伸縮振動。CH2和CH3基團伸縮振動譜帶反映膜磷脂分子內碳氫鏈構象的無序化程度［11］。光動力損傷后，2 858 cm－1峰峰值明顯減弱，峰位向高波數位移5 cm－1，說明磷脂分子碳氫鏈構象的無序化和扭式構型增加，細胞膜上多種功能基團結構受損，從而使細胞膜完整性和流動性下降，膜功能受到嚴重影響。而細胞膜磷脂參與了細胞凋亡的發生，因此推測光動力作用所產生的單線態氧、羥基自由基等與細胞膜磷脂發生氧化反應，引起細胞膜磷脂結構改變，這可能是光動力作用誘導細胞凋亡的分子機制之一。

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