RNA干擾對人食管癌裸鼠移植瘤組織中血管內皮生長因子C表達的影響*

巴玉峰，宋一民，李 印#，張紅新，李素紅，陳奎生，張云漢

1)河南省腫瘤醫院胸外科鄭州450003 2)鄭州大學第一附屬醫院病理科;河南省腫瘤病理重點實驗室鄭州450052

淋巴道轉移是人食管癌轉移的主要方式，且與患者的預后密切相關［1］。血管內皮生長因子-C(vascular endothelial factor C，VEGF-C)可誘導淋巴管增生，促進腫瘤淋巴道轉移，被稱為特異性的淋巴管 生 成 因 子［2］。RNA 干 擾 (RNA interference，RNAi)是一種新興的基因治療技術，具有高效性和高度特異性［3］。作者構建了以人VEGF-C基因為靶標的小分子干擾RNA(siRNA)質粒，經陽離子脂質體介導轉染人食管癌EC9706細胞，并移植于裸鼠皮下形成移植瘤，觀察移植瘤組織中VEGF-C的表達情況，為進一步探討食管癌淋巴道轉移機制及以抗淋巴管生成為靶點的食管癌基因治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌EC9706細胞系(中國醫學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈)。T細胞免疫缺陷的BALB/c SPF SR雌性裸鼠25只(中國醫學科學院實驗動物研究所提供)，鼠齡4～6周，體質量18～22 g。Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR一步法試劑盒(TaKaRa公司)，RT-PCR引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成。VEGFC兔抗人多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。RPMI 1640(海克隆生物化學制品北京有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統為同濟醫科大學千屏影像工程公司產品。馮氏IVC-Ⅱ型獨立送風隔離籠具(蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)。

1.2 siRNA轉染EC9706細胞 根據VEGF-C cDNA已知序列(NM_005429)，參照文獻［4］的方法，利用Ambion和TaKaRa等公司網站提供的設計分析軟件，設計并體外轉錄合成3條含19個核苷酸的siRNA(HX1、HX2和 HX3)和1條無關序列 siRNA(HX4)，序列見表1。

表1 寡核苷酸序列

導入pSINsi-U6載體，得到發卡樣siRNA表達重組質粒。重懸EC9706細胞于RPMI 1640培養液中，以每孔5×105個細胞接種于6孔板，培養24 h使之貼壁生長，當融合達90%時，參照脂質體法轉染試劑盒說明書分組進行轉染，分別是空白對照組(僅加脂質體)、pSINsi-U6-HX1組、pSINsi-U6-HX2組、pSINsi-U6-HX3組、無關序列轉染組和未轉染對照組。轉染48 h后，換含800 mg/L G418培養液繼續培養進行抗性篩選，1周內空白對照組和未轉染對照組細胞全部死亡，其余各組也有80% ～90%的細胞死亡，換用含400 mg/L G418培養液篩選抗性克隆至2周后，挑選陽性克隆，傳代至培養瓶中繼續常規擴大培養。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立 裸鼠隨機分為5組，分別為HX-1、2、3轉染組和無關序列轉染組以及未轉染對照組。將1.2中轉染siRNA質粒的各組EC9706細胞傳代并常規擴大培養，2 g/L胰蛋白酶消化、吹打、無菌生理鹽水重懸制成細胞懸液，注射于裸鼠腋窩皮下(2×106個/只)，動物接種后3～5 d即可見到明顯腫塊突起，SPF環境中飼養4周后處死。

1.4 觀測指標

1.4.1 移植瘤體積和質量測定 頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，剝離移植瘤，洗凈并稱量。

1.4.2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白檢測 采用免疫組化SP法測定，按照試劑盒說明操作。取移植瘤組織，常規制片，依次滴加工作液和VEGF-C多克隆抗體(稀釋度為1∶150)，中止反應后蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，并按說明書推薦的結腸癌標本作陽性對照。VEGF-C蛋白陽性染色為淡黃色或棕深黃色顆粒，定位于細胞質內。每組切片用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統在高倍視野下計數10個視野，并避開移植瘤壞死區域，對腫瘤細胞進行體視學參數——陽性單位(positive unit，PU)測定。PU越大，表示目標物陽性表達強度越高;反之，表達強度越低［5］。

1.4.3 移植瘤組織中VEGF-C mRNA檢測 用Trizol提取移植瘤組織總RNA，RT-PCR檢測各組細胞中VEGF-C mRNA 的方法參照文獻［6］，VEGF-C 引物序列:上游 5’-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3’，下游5’-CCACATCTGTAGACGGACAC-3’，擴增產物大小 229 bp;β-actin引物序列:上游 5’-CATCCT GCGTCTGGACCT-3’，下游 5’-TCAGGAGGAGCAAT GATCTTG-3’，擴增產物大小480 bp。目的基因與內參照物引物同管擴增，按以下條件進行RT-PCR反應:50℃ 30 min，94℃預變性2 min，94℃變性30 s，57.8 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進行 35 個循環。取5 μL擴增產物與2 μL上樣緩沖液混勻，在12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并用凝膠成像分析系統掃描，以VEGF-C與β-actin條帶灰度值的比值表示目的片段的相對表達量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 10.0進行統計分析。對5組移植瘤體積、質量、VEGF-C蛋白的 PU及mRNA相對表達量進行正態性、方差齊性檢驗及單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α =0.05。

2 結果

2.1 5組移植瘤體積及質量的比較 見表2。

2.25 組移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達見圖1、表2。

圖1 移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達

2.3 5組移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達 見圖2與表2。

圖2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達(SP，×400)

表2 5組移植瘤體積、質量、VEGF-C mRNA及蛋白測定結果(n=5)

3 討論

RNAi是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發的序列特異性基因轉錄后的沉默過程，可以破壞特定目的基因轉錄的mRNA，使其功能沉默，而對其他正常基因無影響。RNAi應用不僅為基因功能研究提供了簡單有效的“基因敲除”手段，同時還為病毒感染性疾病、遺傳性疾病及腫瘤的基因治療開辟了新途徑［7］。

近年來，國內對于VEGF-C與食管鱗狀細胞癌淋巴道轉移關系的研究開展較多，均認為食管鱗狀細胞癌組織中VEGF-C的高表達與淋巴結轉移關系密切，且呈正相關［6，8-9］。謝曉斌等［10］應用靶向 VEGF-C 的短發夾RNA(shRNA)對乳癌細胞生物學特性進行了研究，發現VEGF-C shRNA重組質粒載體在乳癌MCF-7細胞中能高效、特異地發揮靶基因沉默作用。

作者將穩定轉染VEGF-C siRNA表達質粒的食管癌EC9706細胞注射于裸鼠皮下，成功構建了移植瘤，并用RT-PCR、免疫組化和體視學技術證明，轉染靶向VEGF-C的siRNA表達載體的EC9706細胞形成的移植瘤組織中VEGF-C mRNA和蛋白表達受抑，尤其是HX2轉染組移植瘤組織中不僅有VEGF-C蛋白與mRNA的表達下調，瘤組織體積和質量也均有所減小，可能是由于VEGF-C系VEGF家族成員，該段序列與VEGF-A同源，從而發揮了抑制生長的生理功能，這也為針對VEGF-C的RNAi提供了一種新思路。HX1、2、3轉染組移植瘤組織中仍可檢出VEGF-C mRNA弱表達，可能與所用RNAi質粒沉默VEGF-C mRNA表達的效率達不到100%有關。

總之，從體內實驗的角度證實，設計和構建的抗VEGF-C表達的siRNA載體可有效抑制食管癌EC9706細胞產生VEGF-C的特性，為食管癌抗淋巴管生成的基因治療提供了理論依據。

［1］杜百廉.食管癌［M］.北京:中國科學技術出版社，1994:188

［2］Royston D，Jackson DG.Mechanisms of lymphatic metastasis in human colorectal adenocarcinoma［J］.J Pathol，2009，217(5):608

［3］Sledz CA，Williams BRG.RNA interference in biology and disease［J］.Blood，2005，106(3):787

［4］Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediates RNA interference in cultured mammlian cells［J］.Nature，2001，411(6 836):494

［5］牛海艷，申洪.ABCG2在肺癌中表達的定量研究［J］.中國體視學與圖像分析，2007，12(3):167

［6］張紅新，張嵐，賀付成.人食管鱗癌中血管內皮生長因子C mRNA的表達及其臨床意義［J］.中國現代醫學雜志，2006，16(24):3 697

［7］Ryther RC，Flynt AS，Phillips JA，et al.siRNA therapeutics:big potential from small RNAs［J］.Gene Ther，2005，12(1):5

［8］龍志強，李簡.食管鱗癌患者組織和血清中VEGF-C的表達［J］.鄭州大學學報:醫學版，2006，41(2):362

［9］劉鵬飛，劉兵團，沈衛東，等.血管內皮生長因子C與其受體在食管鱗癌中的表達及臨床意義［J］.世界華人消化雜志，2008，16(4):431

［10］謝曉斌，龍捷，楊芳，等.靶向血管內皮生長因子C短發夾式RNA對人乳腺癌MCF-7細胞生物學特性的影響［J］.中華病理學雜志，2009，38(7):472