多囊卵巢綜合征來源人胚胎干細胞系的建立及成脂分化*

孫瑩璞，王 芳，孔慧娟，白愛紅，趙 芳，李朋粉

鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心鄭州450052

1998年美國科學家James Thomson和John Gearhart分別首次用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者捐贈的胚胎和流產胎兒的生殖嵴細胞建立人胚胎干細胞(human embryonic stem cells，hESCs)系。此后，hESCs建系成功的報道日益增多。但有關多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者來源的hESCs細胞系的建立目前國內外尚未見報道。

PCOS是育齡婦女最常見的生殖內分泌疾病之一，也是引起育齡期婦女不孕的主要原因之一，但其發病機制至今尚未完全清楚。作者利用PCOS患者IVF-ET周期中廢棄胚胎和冷凍胚胎建立了我國首批PCOS來源的hESCs系，并定向分化為脂肪細胞，以期從干細胞水平探討PCOS的發病機制和干預措施。

1 材料與方法

選取鄭州大學第一附屬醫院生殖醫學中心2007年6月至2008年7月期間的IVF-ET周期，共收集401例患者胚胎移植后廢棄的新鮮胚胎924枚和25例患者分娩后捐贈的冷凍胚胎83枚，均為非PCOS患者。廢棄的新鮮胚胎包括:①卵裂期發育遲滯，不符合移植和冷凍標準的2個原核(pronucleus，PN)胚胎。②受精異常的無原核、單個原核和多個原核(≥3 PN，以3 PN為主)胚胎。依據2003年歐洲人類生殖與胚胎學會(ESHRE)和美國生殖醫學學會(ASRM)在鹿特丹會議上推薦的診斷標準［1］診斷PCOS，共收集同期17例PCOS患者的59個新鮮廢棄胚胎和4例PCOS患者的19枚冷凍胚胎。在征得患者同意并簽署知情同意書后用于hESCs的建系實驗。

將上述所得胚胎序貫培養共形成囊胚237枚，其中優質囊胚114枚。機械法分離內細胞團(ICM)，接種于混合飼養層(小鼠胚胎成纖維細胞∶人包皮成纖維細胞數量比為1∶1)，傳代培養。將得到的胚胎干細胞進行脂肪細胞的誘導分化，即在胚胎干細胞誘導分化培養基(α-MEM+體積分數10%血清替代品)中添加10 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基 3-異丁基黃嘌呤，另外添加不同濃度的羅格列酮和堿性成纖維細胞因子(bFGF)，反復實驗摸索最佳的培養體系和方法。

2 結果

2.1 建系情況 共建立hESCs 17株，其中PCOS來源5株，非PCOS來源12株。均在體外傳25代以上，對穩定傳代的2種來源的hESCs進行相關鑒定，結果顯示:所建立的hESCs具有干細胞的全部特性，光鏡下呈集落樣生長(圖1)，表達堿性磷酸酶(AKP);細胞免疫熒光法檢測表面抗原階段特異性胚胎表面抗原(SSEA)-1均陰性，SSEA-4陽性;RTPCR檢測細胞內特異基因表達，可見轉錄因子OCT-4高水平表達;懸滴法培養時，體外分化為擬胚體;將hESCs細胞注入SCID小鼠皮下或肌肉內，可得到畸胎瘤;核型分析顯示核型均正常。

圖1 倒置顯微鏡下觀察到的hESCs克隆(×40)

圖2 誘導分化21 d的脂肪細胞(×40)

2.2 胚胎干細胞向脂肪細胞的定向分化 建立了hESCs向脂肪細胞體外定向分化效率較高的實驗模型，即 10 μmol/L 羅格列酮聯合 5 μmol/L bFGF 后半周期誘導得到的脂肪細胞最多(圖2)。分化得到的脂肪細胞不僅具有脂肪細胞的形態，還有聚集甘油三酯及成熟脂肪細胞的功能。

3 討論

PCOS是育齡婦女最常見的一種復雜的內分泌紊亂、糖代謝異常及脂代謝異常所致的病理狀態，以長期無排卵、高雄激素血癥和胰島素抵抗為特征，5% ～10%的育齡婦女受到其困擾［2］。其對婦女健康的危害遠非僅影響生殖功能。然而，迄今為止，PCOS的發病機制尚不清楚。遺傳可能是其病因學上一個重要因素［3］。目前有研究［4］報道 PCOS病變起始于胚胎期，嬰兒且出生后對雄激素易感，在育齡期較早出現PCOS癥狀，說明可能在干細胞階段PCOS胚胎的基因時空調控即存在差異位點。PCOS的遺傳特性及胚胎期異常提示可嘗試從hESCs著手，探究PCOS的發病機制、基因定位和治療等。采用PCOS來源的hESCs系進行研究，可以摒除環境因素的影響，探討PCOS胚胎早期的遺傳變化。同時利用hESCs無限傳代的特性，可避免重復取患者組織或體液的痛苦，也可避免動物模型的諸多弊端。目前國內外尚無關于PCOS來源的hESCs建系成功的報道。作者經過反復實驗，成功建立了穩定的PCOS來源的 hESCs系，該細胞系具有干細胞的全部特征。

干細胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細胞群體。胚胎干細胞是最原始的干細胞，它位于個體發育的頂端，具有發育的全能性，可以分化成為人體中全部的組織細胞。但到目前為止，所有體外誘導胚胎干細胞定向分化的物質只能提高某一分化組織在分化群落中的比例，不能誘導形成單一組織［5］。脂肪細胞的分化過程極其復雜，它包括有特殊的分化生長因子參與的誘導環境的作用及相關細胞信號傳導通路的激活。影響hESCs分化為脂肪細胞的因素眾多，選擇合適的細胞因子和激素，建立可靠穩定的培養方案，才能有效提高hESCs的脂肪分化效率。

胰島素是一種促生長因子，它是體內唯一促進脂類合成并抑制其水解的激素，能促進前脂肪細胞聚集脂肪細胞分解釋放的脂滴以形成新的脂肪細胞;還能抑制腎上腺素和兒茶酚胺的脂解作用。地塞米松是糖皮質激素的一種，主要是通過細胞核內的糖皮質激素作用元件發揮作用。羅格列酮可高選擇性激活核受體過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)。PPARγ不僅能促使細胞停止生長，引發脂肪細胞分化，還能維持成熟脂肪細胞的表型，在調節脂肪細胞分化中起關鍵作用［6］。bFGF是一種具有廣泛作用的生物活性物質，具有促血管生成作用，對前脂肪細胞的增殖和分化可能起促進作用［7］。作者在干細胞克隆已充分擴增而尚未自發分化時，加入上述5種因子誘導hESCs向脂肪細胞定向分化，隨著分化時間的延長，甘油三酯水平逐漸升高，在較短的時間內使2種來源的hESCs均分化為成熟脂肪細胞。這為后續研究奠定了基礎。

［1］Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long term health risks related to polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2004，81(1):19

［2］Allahbadia GN，Merchant R.Polycystic ovary syndrome in the Indian Subcontinent［J］.Semin Reprod Med，2008，26(1):22

［3］Legro RS，Strauss JF.Molecular progress in infertility:polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2002，78(3):569

［4］Goodarzi MO. Lookingforpolycysticovary syndrome genes:rational and best strategy［J］.Semin Reprod Med，2008，26(1):5

［5］Kawano H，Cody RJ，Graf K，et al.AngiotensinⅡenhances integrin and alpha-actinin expression in adult rat cardiac fibroblasts［J］.Hypertension，2000，35(1 Pt 2):273

［6］Kereiakes DJ，Willerson JT.Metabolic syndrome epidemic［J］.Circulation，2003，108(13):1552

［7］王陽，戚可名，馬越波.我院自體脂肪顆粒注射移植十年回顧［J］.中華整形外科志，2002，18(2):95