脂質體介導的hTERT PEI/ASODN縮合體對乳癌MCF-7細胞生長及hTERT表達的影響*

權松霞，張振中，邵彥江，王曉娟，李惠翔#

1)鄭州大學基礎醫學院病理學教研室;鄭州大學第一附屬醫院病理科鄭州450052 2)鄭州大學藥學院鄭州450001

端粒酶(telomerase)是一種核蛋白酶，以其自身RNA為模板，逆轉錄合成端粒DNA，在染色體末端增加TTAGGG重復序列以補償端粒的縮短，在絕大多數的細胞永生化和腫瘤的形成過程中起關鍵性作用［1］，針對端粒酶為靶點的腫瘤治療策略是近年來研究的熱點［2］。人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是合成端粒酶的限速亞單位，它的表達量對端粒酶的活性調控起著決定性作用［1-4］。利用反義核酸技術，人工合成hTERT mRNA反義寡核苷酸(ASODN)抑制端粒酶的表達，誘導腫瘤細胞凋亡，是目前腫瘤基因治療的方向之一。未經修飾的寡核苷酸易被核酸酶降解，細胞攝入率低。聚乙烯亞胺(PEI)可將ASODN縮合成納米大小的顆粒狀物，有利于ASODN進入細胞內。但是，PEI具有明顯的細胞毒性，而 PEI/ASODN縮合體在體內應用時會被單核吞噬細胞迅速清除。脂質體作為一種載體，可將藥物粉末或溶液包埋在直徑為納米級的微粒中，這種微粒具有類細胞結構，進入人體后被網狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織或器官中積蓄，從而提高藥效，減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性［5］。作者以脂質體作為 hTERT PEI/ASODN縮合體的載體，觀察其對乳癌MCF-7細胞生長和hTERT表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 縮合體由課題組自制。RPMI 1640培養基和胰蛋白酶購自Gibco公司，優級胎牛血清購自天津TBD公司，MTT為Amreseo公司產品，兔抗人hTERT多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產品，通用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均為北京中杉金橋生物技術有限公司產品，Trizol試劑為Sigma公司產品，其他化學試劑均為國產分析純。梯度PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)，TCS-SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，高速低溫臺式離心機(美國Beckman公司)，酶標儀(奧地利TECAN公司)。

1.2ASODN和正義寡核苷酸(SODN)的設計與合成 根據hTERT DNA基因序列(AF128893)設計ASODN， 序 列 為:5’-CCGCCCTCTCCTCGCG GCGCGAGTT-3’;作用位點是調節hTERT基因轉錄的Sp1蛋白的結合位點。另設計SODN序列作對照:5’-GAGCATTAGCACCGCGGGC-3’。經計算機網上 BLAST檢索，上述 ASODN及 SODN序列與hTERT基因以外的人類基因均無同源性，均由北京奧科生物技術有限責任公司合成。

1.3 細胞培養 人乳癌MCF-7細胞由河南省醫藥科學研究院王慶端教授提供。用含體積分數10%的滅活胎牛血清，含100 mg/L青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養基，在37℃、體積分數5%CO2飽和濕度條件下培養，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化，換液傳代。

1.4 縮合體攝取情況的觀察 采用6孔板制備細胞爬片，轉染前用無血清RPMI 1640沖洗3遍，每孔加入無血清RPMI 1640培養液800 μL，其中2孔加100 mg/L ASODN-熒光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L PEI/ASODN-熒光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L脂質體-PEI/ASODN-熒光素各200 μL，培養2 h后，棄轉染液，PBS沖洗3遍，用體積分數75%的冰乙醇固定30 min，取出細胞爬片，置于載玻片上，采用激光共聚焦掃描顯微鏡于透射模式觀察細胞輪廓及形態，激光激發模式(激發波長488 nm)下觀察縮合體攝入情況。

1.5 細胞轉染 取處于對數生長期的細胞，于轉染前1 d，96孔板按8×103/孔、6 孔板按2 ×105/孔接種細胞，置培養箱中培養過夜。轉染前用無血清RPMI 1640洗板2次。實驗分9組:空白對照組、ASODN 組(20 mg/L)、SODN 組(20 mg/L)、溶媒組、空白脂質體組、PEI/ASODN組(20 mg/L)、PEI/SODN組(20 mg/L)、脂質體-PEI/ASODN組(20 mg/L)和脂質體-PEI/SODN組(20 mg/L)。各組試藥用無血清培養液按比例稀釋后小心滴入細胞并充分混勻，培養4 h后，棄轉染液，PBS沖洗3遍后更換正常含血清及RPMI 1640培養基，并進行以下觀察。

1.6 細胞形態學觀察 在細胞培養狀態下，用倒置顯微鏡觀察各組細胞轉染24 h生長狀態及形態學變化。

1.7 細胞的生長情況 取出分別培養24、48和72 h的各組細胞，每孔加入終濃度為5 g/L的MTT溶液 20 μL，4 h 后加入二甲基亞砜 150 μL，振蕩 10 min，用酶標儀測492 nm處的光密度值。

1.8 hTERT蛋白的檢測 采用免疫細胞化學法。制備各組轉染48 h后的細胞爬片，使用免疫細胞化學SP法檢測hTERT蛋白的表達。一抗為兔抗人hTERT多克隆抗體(工作濃度1∶100)，按試劑說明書操作，DAB顯色，蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察，陽性結果為胞核或胞質著棕黃色。

1.9 hTERT mRNA水平測定 采用RT-PCR法。hTERT基因PCR擴增引物參照文獻［3］，并經Gen-Bank檢索證實。hTERT上游引物:5’-CGGAAGA GTGTCTCCAGCAA-3’，下 游 引 物:5’-GGAT GAAGCGGAGTCTGGA-3’，擴增片段長度為145 bp。內參 β-actin上游引物:5’-CAAGGCCAACCGC GAGAAGATG-3’，下 游 引 物:5’-GTCCAGGGCG ACGTAGCACAGC-3’，擴增片段長度330 bp。上述引物均由上海博興公司合成。各組細胞于轉染48 h后應用Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉錄得cDNA，用于PCR。擴增條件:50℃逆轉錄30 min，94℃逆轉錄酶失活2 min;94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環;72℃延伸6 min。擴增產物點樣于20 g/L瓊脂糖凝膠，應用凝膠成像分析處理系統攝像。

1.10 統計學處理 采用SPSS 11.0處理數據。各組細胞轉染24、48和72 h光密度值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準 α =0.05。

2 結果

2.1 體外攝取實驗觀察結果 單純的ASODN轉染時細胞內熒光強度極弱;PEI/ASODN組、脂質體-PEI/ASODN復合物轉染細胞2 h后，可見大量熒光物質聚集在細胞核中。見圖1。

2.2 形態學觀察結果 空白對照組、ASODN組、SODN組、溶媒組、空白脂質體組、脂質體-PEI/SODN組均生長狀態良好;PEI/SODN組、PEI/ASODN組在轉染4 h后，可見細胞表面黏附大量大小相似的顆粒;脂質體-PEI/ASODN組轉染后隨時間的延長，細胞體積變小，形態狹長，間隙增大，連接松散，貼壁細胞逐漸變圓、漂浮。見圖2。

2.3 細胞的生長情況 各組細胞轉染24、48和72 h后，MTT法測得的光密度值比較見表1。

表1 各組細胞轉染24、48和72 h的光密度值比較(n=3)

2.4 轉染細胞hTERT mRNA檢測結果 見圖3。

圖3 轉染48 h后各組細胞hTERT mRNA的表達

2.5 轉染細胞hTERT蛋白檢測結果 轉染48 h時，空白對照組、ASODN組、SODN組、溶媒組、空白脂質體組、PEI/SODN組及脂質體-PEI/SODN組細胞為陽性著色;PEI/ASODN及脂質體-PEI/ASODN組細胞為陰性著色。見圖4。

圖4 轉染48 h后各組細胞hTERT蛋白的表達(免疫細胞化學SP法，×400)

3 討論

反義核酸技術是根據堿基互補原理，用人工合成或生物體合成的特定的反義核酸來抑制或封閉基因表達的技術［4］，但是未經修飾的寡核苷酸易被胞內核酸酶降解。該研究運用PEI將ASODN有效壓縮以后，制備成氮磷比為10的PEI-ASODN納米微粒縮合體，再用中性脂質體將其有效包裹后，轉染人乳癌MCF-7細胞。實驗表明:該載體可以有效進入細胞內，并抑制細胞的生長，這與多數學者的研究結果相似［6］。PEI/ASODN、PEI/SODN 也顯示出較強的抑制MCF-7細胞生長的作用，但在轉染4 h后，可見細胞表面黏附大量大小相似的顆粒，與文獻［7］報道一致，即PEI在細胞膜上可形成2～6 μm的團片狀物，而脂質體-PEI/SODN組和脂質體-PEI/ASODN組并無此種表現，說明中性脂質體通過對PEI/SODN或PEI-ASODN的有效包裹，很好地降低了PEI的細胞毒性。此外，該研究還顯示，hTERT ASODN作用于MCF-7細胞48 h后hTERT基因表達未被完全抑制，表明 hTERT ASODN只能下調hTERT基因的表達，并不能完全封閉該基因。這一結果進一步證實hTERT的調控是非常復雜的，要結合其他的細胞調控途徑綜合評價。

總之，該研究結果顯示hTERT基因的ASODN以序列特異性方式抑制基因的表達，從而抑制端粒酶活性，證實了中性脂質體作為載體的有效性和安全性;可以通過對中性脂質體進行修飾及與特定細胞表面受體的配體相偶聯，達到靶向性基因轉染的目的，為腫瘤靶向性的基因治療的體內研究提供一種新的方法。

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［2］Greider CW.Telomerase activity cell，proliferation and cancer［J］.Proc Natl Acid Sci USA，1998，95(1):90

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［4］Tao M，Miyano Kurosaki N，Takai K，et al.Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent，FuGENE6-antisense phosphorothioate oligonucleotide complex in Hela cells［J］.FEBS Lett，1999，454(3):312

［5］Harada-Shiba M，Yamauchi K，Harada A，et al.Polyion Complex micelles as vectors in gene therapy-pharmacokinetics and in vivo gene transfer［J］.Gene Ther，2002，9(6):407

［6］Herbert BS，Pongracz K，Shay JW，et al.Oligonucleotide N3’→P5’phosphoramidates as efficient telomerase inhibitions［J］.Oncogene，2002，21(4):638

［7］李經忠，王青青，余海.新型非病毒載體聚乙烯亞胺介導基因轉染參數的研究［J］.中國生物醫學工程學報，2006，25(4):481