白蛋白聯合低氧對NRK-52E細胞凋亡的影響

王 沛，劉章鎖，梁獻慧，駱 紅，馬 瑨，石新慧

鄭州大學第一附屬醫院腎內科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室鄭州450052

持續存在的白蛋白尿是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進展到終末期腎衰竭的危險因素［1-2］。腎小球濾過的白蛋白幾乎100%在腎小管重吸收并被分解而回到血液循環，這種重吸收過程會消耗大量的能量，而由于腎臟本身結構的因素，腎小管區域的氧分壓又比較低，因此臨床上低氧張力常同白蛋白過負荷同時存在［3］。另外，白蛋白誘導腎小管上皮細胞(tubular epithelial cell，TEC)凋亡是造成腎臟纖維化的起始因素［4-5］。白蛋白過負荷與低氧張力在促進腎臟纖維化方面是否存在某些聯系尚未見報道。作者觀察了白蛋白聯合低氧刺激對TEC凋亡的影響，以探討白蛋白促進腎臟損傷的機制，為臨床干預提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 去脂的小牛血清白蛋白(美國Sigma公司)，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物公司)，Trizol(Invitrogen公司)，bax和bcl-2 PCR擴增引物、DNA Marker、AMV逆轉錄試劑盒及PCR擴增試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司)，DMEM/F12 1∶1培養基(美國Hyclone公司)，2.5 g/L胰蛋白酶(杭州吉諾生物公司)。CO2培養箱(德國Heraeus Instruments公司)，MCO-18M Multigas Incubator(日本三洋公司)，IX40型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細胞培養 大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E，由中山醫科大學第一醫院余學清教授惠贈)NRK-52E細胞用含體積分數為10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12 1∶1培養基培養，同時加入100 kU/L青霉素、100 U/mL鏈霉素，以2.5 g/L胰蛋白酶消化后置37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養，并按1∶3進行傳代。傳代后的細胞均勻接種，生長至亞融合狀態時加人無血清培養基同步化12 h，隨后使用第3～6代細胞進行實驗。

1.3 NRK-52E細胞凋亡的 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞技術檢測 以不同質量濃度(0、10、20、30和40 g/L)白蛋白下常氧(含體積分數為5%CO2的空氣)條件下孵育NRK-52E細胞24 h后，流式細胞技術檢測的各組細胞的凋亡率，得到最適合白蛋白質量濃度;然后NRK-52E細胞在最適合白蛋白質量濃度和低氧(體積分數為1%O2、5%CO2和94%N2)聯合條件下刺激24 h，同對設常氧對照組、低氧對照組和常氧+30 g/L白蛋白培養組。以2.5 g/L胰蛋白酶(不含EDTA)消化收集各處理組細胞，用冷 PBS液(pH=7.0)漂洗 2 次，用 200 μL 結合緩沖液重懸并調整成1×106mL－1的單細胞懸液。取100 μL細胞懸液，加入AnnexinⅤ-FITC和PI各5 μL，混勻后室溫避光反應 10 min，再加入 300 μL Binding Buffer，1 h內上機檢測細胞凋亡率。

1.4 NRK-52E細胞 bax和 bcl-2 mRNA表達的RT-PCR法檢測 各組細胞分別加入1 mL Trizol，細胞懸液移入EP管，劇烈振蕩，加入氯仿靜置分層，取水相，異丙醇沉淀抽提總RNA。采用上海生工生物工程技術服務有限公司的AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，取總RNA 5 μg，參照操作步驟反轉錄成cDNA，取1 μL作為模板進行PCR擴增，反應體系為 20 μL。bax上游引物 5’-ACCAAGAAGCT GAGCGAGTGTC-3’，下游引物 5’-ACAAAGATGGT CACTGTCTGCC-3’，擴增產物大小為365 bp。bcl-2上游引物 5’-CACCCCTGGCATCTTCTCCTTC-3’，下游引物 5’-CACAATCCTCCCCCAGTTCACC-3’，擴增產物大小為303 bp。內參 GAPDH上游引物5’-AATGCATCCTGCACCACCAA-3’，下游引物序列:5’-GTAGCCATATTCATTGTCATA-3’，擴增產物大小為516 bp。PCR反應條件:預變性94℃3 min;94℃變性45 s，退火溫度bcl-2為67℃，bax為58℃，72℃延長45 s，共30個循環;反應結束前72℃ 5 min以充分延伸。取PCR產物10 μL經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，經凝膠掃描系統進行吸光度積分掃描，計算bcl-2和bax與內參照GAPDH灰度值的比值。實驗重復3次。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0進行統計分析，應用單因素方差分析比較不同質量濃度白蛋白對常氧條件下NRK52E細胞凋亡的影響以及不同處理組NRK-52E細胞凋亡率、bax mRNA和bcl-2 mRNA表達的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同質量濃度白蛋白對常氧條件下NRK-52E細胞凋亡的影響 在常氧條件下，隨著白蛋白質量濃度的增加(0、10、20、30 和40 g/L)，NRK52E 細胞的凋亡率也逐漸增高［(5.23±3.24)%、(9.08±3.67)%、(15.70 ± 3.43)%、(25.59 ± 3.32)% 和(29.12 ±4.29)%］，差異有統計學意義(F=55.748，P ＜0.001)。

2.2 不同處理組 NRK-52E細胞凋亡率、bax和bcl-2 mRNA表達的比較 見圖1、表1。

圖1 不同處理組NRK-52E

表1 不同處理組NRK-52E細胞凋亡率、bax和bcl-2 mRNA表達的比較(n=3)

3 討論

Erkan等［6］用不同質量濃度的白蛋白培養腎小管上皮細胞LLC-PK1，發現LLC-PK1細胞在攝取白蛋白的同時出現了凋亡增加，并且凋亡的細胞與攝取白蛋白的細胞一致。Thomas等［7］應用白蛋白腹腔注射造成白蛋白過負荷大鼠模型，發現這些大鼠在出現大量蛋白尿的同時出現了TEC凋亡。作者的研究結果顯示白蛋白可誘導NRK-52E凋亡，與上述文獻報道相符。

Bcl家族凋亡蛋白在調控細胞凋亡中發揮重要作用［8-9］。有研究［10］認為低氧可促進 TEC 凋亡，其機制可能與低氧直接降低凋亡蛋白Bcl-2表達或Bcl-2/Bax比值有關，但另一些研究［11］認為低氧對細胞凋亡無直接影響。作者的研究結果顯示低氧本身不增加大鼠TEC的凋亡，但可增強白蛋白誘導細胞凋亡的作用，其機制可能與進一步促進Bax高表達和Bcl-2低表達有關。

［1］Hemmelgarn BR，Manns BJ，Lloyd A，et al.Relation between kidney function，proteinuria，and adverse outcomes［J］.JAMA，2010，303(5):423

［2］Pavkov ME，Knowler WC，Hanson RL，et al.Predictive power of sequential measures of albuminuria for progression to ESRD or death in Pima Indians with type 2 diabetes［J］.Am J Kidney Dis，2008，51(5):759

［3］Heyman SN，Khamaisi M，Rosen S，et al.Renal parenchymal hypoxia，hypoxia response and the progression of chronic kidney disease［J］.Am J Nephrol，2008，28(6):998

［4］Birn H，Christensen EI.Renal albumin absorption in physiology and pathology［J］.Kidney Int，2006，69(3):440

［5］Ohse T，Inagi R，Tanaka T，et al.Albumin induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in renal proximal tubular cells［J］.Kidney Int，2006，70(8):1 447

［6］Erkan E，Devarajan P，Schwartz GJ.Mitochondria are the major targets in albumin-induced apoptosis in proximal tubule cells［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(4):1 199

［7］Thomas ME，Brunskill NJ，Harris KPG，et al.Proteinuria induces tubular cell turnover:a potential mechanism for tubular atrophy［J］.Kidney Int，1999，55(33):890

［8］楊國杰，李運偉，曾秋棠，等.缺血后處理對兔缺血再灌注心肌細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2008，43(1):57

［9］汲振余，趙立群，張聚真，等.食管早期癌和癌前病變組織中HIF-1α、Bax和Survivin的表達對光動力學療效的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2008，43(2):205

［10］Yamamoto K，Tomita N，Yoshimura S，et al.Hypoxia-induced renal epithelial cell death through caspase-dependent pathway:role of Bcl-2，Bcl-xL and Bax in tubular injury［J］.Int J Mol Med，2004，14(4):633

［11］Box AH，Yuen C，Ponjevic D，et al.Signaling and apoptosis differences between severe hypoxia and desferoxamine treatment of human epithelial cells［J］.Biochem Cell Biol，2008，86(5):425