用阻抗法快速測定巴氏奶中菌落總數(shù)

谷福

0 前言

目前我國進(jìn)行食品質(zhì)量安全準(zhǔn)入制度（QS），菌落總數(shù)作為巴氏奶的出廠檢驗項目是判定食品被微生物污染程度的重要指標(biāo)之一，按國標(biāo)GB/T 4789.2進(jìn)行檢測，菌落總數(shù)的結(jié)果的報出需要48h，但是巴氏奶的保質(zhì)期只有3d。為了延長巴士奶的貨架期，減少檢驗的時間，有必要為尋求一種快速、有效、簡便的檢測方法,本文用BacTrac4300“微生物定量分析儀”,對巴氏奶中菌落總數(shù)進(jìn)行測定。實驗說明，用阻抗法代替GB/T 4789.2測定巴氏奶的菌落總數(shù)作為出廠檢驗項目是可行的，需要實驗時間約4h～6h，具有快速準(zhǔn)確的特點。

1 阻抗法實驗原理

阻抗法是通過測量微生物代謝引起的培養(yǎng)基電特性變化來測定樣品微生物含量的一種快速檢測方法。微生物在培養(yǎng)過程中,生理代謝作用使培養(yǎng)基中的物質(zhì)（如碳水化合物、類脂、蛋白質(zhì)）等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醋酸鹽、乳酸鹽或氨鹽等小分子物質(zhì)電活性物質(zhì)。研究表明，隨著微生物增長,培養(yǎng)基中電活性分子和離子增多，使導(dǎo)電性增強(qiáng),電阻抗降低。電導(dǎo)率隨時間的變化曲線與微生物生長曲線相似,出現(xiàn)緩慢增長期、加速增長期、指數(shù)增長期和緩慢減少期,最后趨于穩(wěn)定期。微生物的起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長期的時間也不同,通過建立二者之間的關(guān)系,就能通過檢測培養(yǎng)基電特性變化推算出微生物的起始菌量。將培養(yǎng)基阻抗變化的相對值定義為 M值，M=（R0-RT）/R0×100%,其中，R0 表示測量開始時培養(yǎng)基的阻抗值，RT表示測量開始后任意時刻培養(yǎng)基的阻抗值，M值最終表示了培養(yǎng)基電阻減少的百分?jǐn)?shù)。電阻越小微生物越多。因此測定M值的變化，即可檢出微生物的數(shù)量。為描述因微生物的顯著生長而引起培養(yǎng)基阻抗的下降，需要設(shè)定一個M值的閾值，從測量開始到該微生物生長曲線達(dá)到設(shè)定的閾值所需的時間就是阻抗檢測時間（IDT）。微生物的起始數(shù)量不同,出現(xiàn)指數(shù)增長期的時間也不同,在一定范圍內(nèi)，菌落形成單位（CFU）的對數(shù)Log（CFU）與IDT呈直線關(guān)系，通過測定同類樣品的一系列CFU（平板計算法）和相對應(yīng)的IDT，即可制定出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過建立二者之間的關(guān)系,就能通過檢測培養(yǎng)基電性變化推出微生物的原始菌量。對于未知樣品，只要檢測其IDT，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以得到CFU值。

本研究用我實驗室已制成巴士奶標(biāo)準(zhǔn)曲線分別用儀器法和國標(biāo)法測樣品的菌落總數(shù)并將結(jié)果進(jìn)行了比較。

2 材料和方法

2.1 儀器和試劑

（1）BacTrac4300微生物定量分析儀,檢測菌落總數(shù)培養(yǎng)基BiMedia002A由SY-LAB提供。

（2）平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（GB/T 4789.2-2008），廣東省環(huán)凱微生物科技有限公司。

2.2 檢測樣品

市售的巴士奶10個批次。

2.3 平板計數(shù)法

按國標(biāo)GB/T 4789.2-2008操作，加入1∶10樣品稀釋液，36±1℃培養(yǎng) 48h。

2.4 阻抗測定法

每個測定瓶加入9mlBiMedia002A培養(yǎng)基，高壓滅菌，測定前將測定瓶置于36℃，10個巴氏奶樣品，共用20個測定瓶，取1mL樣品，樣品按GB/T 4789.2-2008進(jìn)行做10-1、10-2、10-3等稀釋,各取1ml樣品稀釋液加入1個測定瓶,然后放入BacTrac4300。記錄結(jié)果由計算機(jī)輸出。儀器設(shè)置：溫度:30℃，最大反應(yīng)時限：24h，測量間隔:5min，M-value 的閾值:5%，輸入樣品標(biāo)記，有計算機(jī)自動控制測量模式。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對同一樣品，用平板法和阻抗法同時進(jìn)行樣品測定。當(dāng)Bactrac的細(xì)菌生長曲線達(dá)到設(shè)定的閾值時，測定結(jié)束，儀器將自動記錄的數(shù)據(jù)為阻抗檢測時間（IDT）。將平板計數(shù)所得數(shù)據(jù)和對應(yīng)的IDT值輸入計算機(jī)，Bactrac即以IDT為橫坐標(biāo)，以log（CFU）為縱坐標(biāo)，用直線回歸法作二者相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 樣品的檢測

對于每個廠家的產(chǎn)品都做一個標(biāo)準(zhǔn)曲線，把樣品1∶10稀釋后接種檢測瓶，選定標(biāo)準(zhǔn)曲線即開始檢測。測試結(jié)束后，Bactrac根據(jù)該樣品的IDT值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上自動計算出CFU。

3 結(jié)果判斷

（1）按國標(biāo)GB5408.1,巴氏奶菌落總數(shù)≤30000CFU/ml為合格。

（2）儀器法：根據(jù)本實驗室做的二條標(biāo)準(zhǔn)曲線,消毒牛乳為DT≥3.0h為合格。

4 結(jié)果討論

實驗結(jié)果（表1，表2）表明，巴氏奶的兩種檢測方法在合格率和數(shù)值無顯著性差異（p＞0.05），這兩種方法的優(yōu)缺點比較：①儀器法利用電阻抗可測試菌落總數(shù)，具有時間短的特點，國標(biāo)法耗時，需2d，而電阻法可在短時間內(nèi)（4h～6h）檢測大量樣品，如樣品菌含量越多，出結(jié)果越更快。②儀器法簡單、方便，巴氏奶樣品可直接進(jìn)行檢測或某些巴士奶的樣品如果含有高的鹽分。這些鹽離子使培養(yǎng)基本身帶有很強(qiáng)的導(dǎo)電性，掩蓋了微生物代謝產(chǎn)生的阻抗變化，需要進(jìn)行稀釋后再測。③儀器法由計算機(jī)控制檢測過程，實驗數(shù)據(jù)自動記錄，自動分析、儲存，圖表、數(shù)據(jù)一目了然，操作者的誤差機(jī)會較少。④儀器法的缺點是必須先做標(biāo)準(zhǔn)曲線才能使用，測定用的試劑價格較貴。⑤通過電子測量技術(shù)，一旦微生物數(shù)量增殖達(dá)到106CFU/ml～107CFU/ml時，即可檢測信號的變化，這與平板法的108CFU/ml～109CFU才能形成一個可視菌落相比，檢測靈敏度比平板法高出近1000倍。

表1 新老標(biāo)準(zhǔn)胎套色牢度指標(biāo)比較 （單位為級）

表2 新老標(biāo)準(zhǔn)胎套色牢度指標(biāo)比較 （單位為級）

綜上所述，儀器法檢測巴氏奶的菌落總數(shù)的是可行的，檢測結(jié)果和國標(biāo)法做出的結(jié)果無顯著差異，對巴氏奶食品企業(yè)的質(zhì)量控制，食品衛(wèi)生監(jiān)督、檢測提供了一條快速、準(zhǔn)確的新途徑。

[1]顧其芳等.測定食品中的細(xì)菌總數(shù)的探索 [J].中國公共衛(wèi)生，1998：14（12）745-746.