腺苷后處理對大鼠缺血再灌注心肌NF-κB和IL-1β的影響

田 金,王 雄

心肌缺血再灌注損傷是臨床上常見的病理生理過程,其機制與炎癥因子的產生有關,尋找能有效減少炎性因子水平的藥物,已成為缺血再灌注藥物研究的重要方面。腺苷作為機體一種重要的內源性活性物質,其心臟保護作用成為近幾年研究的熱點[1-3],腺苷預處理可抑制缺血再灌注后的炎性反應[4]。本研究擬進一步觀察在缺血再灌注后給藥對大鼠心肌細胞核因子κ B(NF-κ B)及白細胞介素-1β(IL-1β)的影響,以明確腺苷后處理是否和缺血預適應同樣具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備 雄性清潔級Wistar大鼠(由山西醫科大學實驗動物中心提供),體重(220～250)g,經20%烏拉坦(5 ml/kg)腹腔麻醉,以針形電極插四肢皮下,觀察記錄標準Ⅱ導聯心電圖。以小動物呼吸機行機械通氣。開胸暴露心臟,在左冠狀動脈前降支距左心耳下緣2 mm處穿過絲線,提起后以套管夾閉造成冠狀動脈阻塞。心肌缺血依據心電圖ST段抬高確認;再灌注依據ST段恢復確認。手術結束后輸入液體,控制30 min后開始實驗。

1.2 動物分組及處理 32只大鼠隨機分為4組,每組8只。假手術組:開胸只穿線不結扎血管,麻醉維持150 min;缺血再灌注組(I/R):結扎 LAD 30 min,再灌注 120 min;缺血后處理組:缺血30 min,再灌注30 s停止灌注30 s,重復 3次,再灌注120 min;腺苷組:結扎 LAD 30 min后,股靜脈緩慢滴注腺苷305 μ g/(kg?min),持續 5 min,再灌注 120 min。

1.3 光鏡觀察 各組切取相同部位心尖部心肌組織,光鏡下觀察心肌結構變化。

1.4 心肌組織NF-κ B的活化及免疫組化檢測 按非生物素二步法免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)說明書操作,取石蠟切片按程序脫蠟,3%(v/v)H2O2滅活內源性酶,微波抗原修復,以 1∶100的兔抗大鼠NF-κ B65多克隆抗體為一抗,山羊抗兔IgG為二抗,加酶標記物,DAB顯色,光鏡下觀察。應用Leica圖像分析系統進行分析。每張切片隨機選取10個區域,計算每個區域中染色部分占整個區域面積的百分比,以均值表示每個心肌中陽性信號面積。

1.5 心肌組織中IL-1β含量的測定 取0.05 g的心肌組織,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)在4℃條件下勻漿,再離心20 min,轉速1 200/min,取上清液用于 IL-1β測定,根據 ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司)中提供的步驟操作,測出IL-1β含量。

2 結 果

2.1 腺苷對心肌組織形態學的影響 假手術組心肌細胞排列整齊,心肌纖維完整,排列整齊,著色均勻,無變性壞死,間質未見炎性細胞浸潤。I/R組心肌細胞排列紊亂,心肌纖維著色不均,排列紊亂,部分心肌纖維斷裂,心肌細胞呈現大片狀壞死,壞死區域紅染、界線不清,間質可見大量炎性細胞浸潤。缺血后處理組同腺苷后處理組心肌細胞排列較I/R組整齊,心肌纖維著色不均,排列紊亂,可見點灶狀壞死,壞死范圍比I/R組小,間質可見少量炎性細胞浸潤。

2.2 腺苷對心肌NF-κ B表達的影響 假手術組NF-κ B的表達面積較小。I/R組NF-κ B的表達面積大,范圍廣,并可見有細胞核內表達,說明有部分NF-κ B在活化過程中轉移到核內。缺血后處理及腺苷后處理組的NF-κ B表達的陽性面積均明顯小于I/R組,且其陽性表達的強度也要弱于I/R組(P＜0.01);而缺血后處理及腺苷后處理組之間進行統計學比較無明顯差異;I/R組、缺血后處理組及腺苷后理組明顯大于假手術組(P＜0.01)。詳見表1。

2.3 腺苷對心肌IL-1β含量的影響 缺血后處理組與腺苷后理組大鼠心肌IL-1β水平較I/R組明顯下降(P＜0.01);而腺苷處理組與缺血后處理組心肌中IL-1β水平無統計學意義(P＞0.05);I/R組、缺血后處理組及腺苷后理組較假手術組心肌IL-1β水平明顯升高(P＜0.01)。詳見表1。

表1 大鼠心肌組織NF-κ B面積和IL-1β含量比較(±s)

表1 大鼠心肌組織NF-κ B面積和IL-1β含量比較(±s)

組別 鼠數(只)NF-κ B面積(%) IL-1β(pg/g)假手術組 8 9.98±5.01 22.36±3.2 I/R組 8 51.55±8.651) 60.25±5.081)缺血后處理組 8 33.40±4.691)2) 39.70±4.971)2)腺苷后處理組 8 31.63±5.431)2) 38.87±5.311)2)與假手術組比較,1)P＜0.01;與I/R組比較,2)P＜0.01

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷的發生機制與諸多因素有關,如氧自由基(OFR)的作用、鈣超載、內皮細胞的激活,炎癥反應的作用,細胞黏附分子(ICAM-1)[5]和NF-κ B[6]等在心肌缺血-再灌注損傷的發生中皆起著非常重要的作用。腺苷是目前在動物實驗和臨床研究中都證實對缺血再灌注損傷有一定保護作用的藥物[7]。腺苷作為機體一種重要的內源性活性物質,可觸發和介導缺血預適應,減輕缺血再灌注損傷,減少無復流現象,從而起到心肌保護作用。很多研究表明腺苷A2a受體產生細胞效應來抑制炎癥反應,減少單核細胞釋放腫瘤壞死因子[8],降低血小板活性[9],而且抑制淋巴細胞活性[10]。本研究顯示,腺苷后處理對缺血再灌注心臟起保護作用,病理損傷減輕,NF-κ B的表達下降以及炎性細胞因子IL-1β的分泌降低。

NF-κ B是一個廣泛存在于哺乳動物細胞中的轉錄因子,參與機體的炎癥反應、免疫反應、細胞分化與凋亡及其他應激反應[11]。細胞處于靜息狀態時,NF-κ B與它抑制因子 Iκ B結合在一起,以無活性的同源或異源二聚體形式存在于多種組織的細胞質中。NF-κ B在心肌I/R損傷中發揮著重要作用,其在缺血、再灌注、氧自由基、白介素等刺激下而激活[12,13],通過一系列細胞信號轉導引起活化,活化的NF-κ B從胞質轉移入細胞核,與靶基因的κ B位點結合而促進炎性細胞因子增加[14],加重組織器官功能的損傷,導致炎癥反應、細胞壞死和細胞凋亡。本研究發現大鼠心肌組織在缺血再灌注后,NF-κ B活性明顯增加,IL-1β表達增強,可證明心肌缺血再灌注確實有炎性反應存在;而給予腺苷后處理后,NF-κ B活化被明顯抑制,同時,IL-1β的表達也顯著減少,說明腺苷后處理可以抑制NF-κ B的激活,降低炎性細胞因子 IL-1β的表達,從而減輕心臟的炎性反應。

本研究結果顯示,腺苷后處理對大鼠缺血再灌注心肌具有保護作用,其部分保護作用機制可能與腺苷后處理抑制NF-κ B活化,從而減少IL-1β的表達,減輕炎癥反應有關。具體中間機制尚有待進一步研究。

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