補陽還五湯對血管性癡呆大鼠行為學和海馬神經元形態學的影響1)

李 君,錢 濤,高維娟,唐敬龍,張鴻波

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是由腦血管疾病所致的智能及認知功能障礙臨床綜合征,它是老年期癡呆中的一種常見類型。在西方國家,VD成為繼阿爾茨海默病(A lzheimer's,AD)之后第二位導致癡呆的病因,而亞洲VD的發病率較高,主要與中風高發有關[1]。隨著人口的老齡化、飲食結構的改變,VD的發病呈增加趨勢。因此,積極探討VD的發病機制和治療方法,具有重要意義。目前,臨床上治療VD有多種藥物,如膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑和神經營養藥物等,但其療效沒有確切統一的結論,分析與VD發病機制的多樣性、復雜性有關。中藥成分復雜,有望在治療VD方面起到改善認知功能的作用。VD屬中醫“呆病”范疇,辨證多屬氣虛血瘀癥,治以益氣活血為主。補陽還五湯作為益氣活血中藥的代表方劑,具有補氣、活血、通絡之功效。本實驗旨在觀察補陽還五湯對VD模型大鼠行為學及海馬組織形態學的影響,為臨床治療VD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康SD雄性大鼠60只,體重20 0 g～250 g,由北京維通利華動物實驗中心供給,合格證號為SCXK(京)2007-0001。實驗條件下自然飲食,適應環境一周后進行實驗。

1.1.2 儀器 Morris水迷宮(LW2II型,中國醫學科學院藥物所);連續變倍體視顯微鏡(XTS20型,北京);冰凍切片機(LEICA CM 1800,Germany);圖像分析儀(Beckman公司,USA);膠凍劑(Thermo Shandon,USA);WH-A300W高頻電刀(北京);江灣Ⅰ型C立體定向儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)。

1.1.3 藥物和試劑 補陽還五湯由黃芪、當歸、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成(北京同仁堂醫藥公司承德分公司提供,批號:080103);尼莫地平片(天津華津制藥廠,國藥準字H 41022175,批號:080317,規格20 mg);Sodium Pentobarbitone(10 g,Germany);多聚甲醛(分析純,天津市化學試劑研究所,批號970606);磷酸氫二鈉(分析純,天津市化學試劑六廠,批號970413),磷酸二氫鈉(分析純,天津市化學試劑六廠,批號970726)。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理 補陽還五湯方劑組成及比例,黃芪∶當歸∶赤芍∶地龍∶川芎∶紅花∶桃仁(80∶4∶3∶2∶2∶2∶2),1 g藥物相當于1 g生藥,按本室方法制備濃度為12.5 g/m L的水煎醇提液,實驗時用雙蒸水配成濃度為6.25 g/m L的混懸液。尼莫地平用雙蒸水經超聲細胞粉碎機制成濃度為2.5 mg/m L的混懸液。高壓滅菌,置4℃冰箱保存備用。

1.2.2 模型制作 采用Pullinsin-4VO改良法制成VD大鼠模型。大鼠腹腔注射1%Sodium Pentobarbitone(10 mg/m L)45 mg/kg麻醉。假手術組大鼠不熱凝椎動脈和不夾閉頸總動脈,其他手術進程同模型組;正常組大鼠不作任何手術處理。

1.2.3 動物分組及給藥方法 將造模成功的大鼠隨機分成模型組、補陽還五湯組和尼莫地平組。另設假手術組及正常對照組,每組12只。補陽還五湯用量為50 g/(kg?d),尼莫地平用量為20 mg/(kg?d),模型組、假手術組和正常對照組均給予蒸餾水1m l/100 g灌胃。術后第1天即用藥,每日灌胃1次,共給藥30 d。

1.2.4 Morris水迷宮試驗

1.2.4.1 定位航行試驗 試驗歷時4 d。每只大鼠每天從4個不同象限入水點入水進行訓練,各1次,取平均值為每天逃避潛伏期。訓練中,若大鼠在60 s內找到平臺,于平臺上站立10 s;若未找到,用棒將其引上平臺,站立10 s,潛伏期限記為60 s。將大鼠從平臺上拿下來休息60 s之后,再按序由下一入水點入水進行下一次實驗。

1.2.4.2 空間探索試驗 第5天撤去平臺,將大鼠從第二象限入水點放入水槽,記錄60 s內其經過平臺象限的次數,即為空間探索次數。

1.2.5 海馬組織形態學觀察 術后30 d,常規取材、固定,用1%Sodium Pentobarbitone 45mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后仰臥固定,剪開右心耳。開顱取腦,并將腦組織置于4%多聚甲醛中浸置4 h～6 h(4℃)后,取視交叉后4 mm與小腦前之間的部分即海馬腦組織,組織經蔗糖溶液脫水。HE染色,酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,光鏡下觀察海馬形態學變化。

1.2.6 海馬CA 1區神經元數目和丟失率的檢測 以圖像分析儀分別對HE染色圖片的海馬CA1區進行處理,測量單位面積海馬神經元數目。采用甲苯胺藍染色計數海馬CA 1區殘余神經元,結果以神經元丟失率(LR)表示。

2 結 果

2.1 行為學檢測 M orris水迷宮定位航行實驗中,模型組的逃避潛伏期明顯長于正常對照組(P＜0.05),補陽還五湯組和尼莫地平組明顯短于模型組(P＜0.05)。在空間探索實驗中,模型組的空間探索次數明顯少于正常對照組(P＜0.05),而補陽還五湯組和尼莫地平組明顯多于模型組(P＜0.05)。和正常對照組相比,假手術組大鼠逃避潛伏期、空間探索次數均無(P＞0.05)。詳見表1。

表1 Morris水迷宮實驗結果(±s)

表1 Morris水迷宮實驗結果(±s)

組別n逃避潛伏期s探索次數/m in正常對照組12 7.67±3.42 16.86±5.37假手術組12 8.76±4.03 14.42±4.01模型組12 29.56±13.281)4.26±0.801)補陽還五湯組12 16.96±7.062)8.96±1.302)尼莫地平組12 20.16±8.892)8.74±2.522)與正常組相比,1)P＜0.05;與模型組相比,2)P＜0.05

2.2 腦組織海馬CA1區神經元形態學 H E染色后正常對照組和假手術組大鼠海馬CA 1區神經元形態規則,層次豐富,細胞線清晰,細胞排列整齊密集,胞核、胞質清晰;模型組大鼠海馬CA 1區神經元排列紊亂、松散,細胞周圍出現間隙,核固縮,染色質深染,可見凝固性壞死伴明顯細胞脫失;補陽還五湯組和尼莫地平組海馬CA 1區神經元形態介于正常組、假手術組和模型組之間,可明顯減輕海馬內核固縮現象。

2.3 腦組織海馬CA1區神經元數目和丟失率 和正常對照組相比,假手術組神經元數目和丟失率無明顯變化;模型組大鼠海馬CA 1區神經元脫失明顯,數目減少,神經元丟失率升高(P＜0.05),可見膠質細胞增生;較模型組相比,補陽還五湯組和尼莫地平組均可見海馬CA 1區神經元脫失現象明顯減輕,數目增多,神經元丟失率明顯降低(P＜0.05)。詳見表2。

表2 大鼠海馬CA 1區單位面積神經元數(±s)

表2 大鼠海馬CA 1區單位面積神經元數(±s)

組別n神經元數/mm2神經元丟失率%正常對照組12 97.28±10.12 0假手術組12 82.56±6.36 1.62±1.70模型組12 44.62±7.351)50.98±5.211)尼莫地平組12 65.32±5.802)16.86±4.172)補陽還五湯組12 74.72±6.502)15.59±3.752)與正常對照組比較,1)P＜0.05;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

血管性癡呆是老年期癡呆的一種重要類型,腦缺血造成海馬損傷引起學習記憶能力下降,是發生VD的重要原因。而海馬是缺血損傷最敏感腦區,直接參與信息貯存和回憶[2,3]。趙建新等[4]認為海馬CA1區神經元的遲發性死亡可能是缺血性腦血管病導致癡呆的主要原因。即使短暫的腦缺血也可造成神經元延遲性神經元死亡[5]。本實驗模型組大鼠海馬CA1區神經元明顯減少,喪失率明顯升高;補陽還五湯組神經元形態和數量則非常接近假手術組和正常組,表明補陽還五湯可以保護缺血對CA 1區神經元的損傷。

益氣活血中藥有顯著的抗VD作用,可明顯改善VD模型大鼠的學習、記憶能力[6-10]。補陽還五湯作為益氣活血中藥的代表方劑具有補氣、活血、通絡之功效。君藥黃芪可補諸虛不足,益元氣;臣以當歸,原方用歸尾,歸尾主通,逐瘀自驗;赤芍、川芎、紅花、桃仁四味為佐,協同歸尾以活血化瘀;地龍通經活絡,力專善走,配合諸藥以行藥勢,用以為使。全方重用補氣藥配合小量活血化瘀藥,使周身元氣流通,血無凝滯。補陽還五湯具有抑制血小板聚集、改善血液流變學狀態、調節腦組織能量代謝和一氧化氮(NO)的生成、抑制腦組織細胞凋亡等作用,從而保護神經元[11-12]。尼莫地平是二氫吡啶類鈣離子通道阻滯劑,具有改善腦循環和腦代謝的作用,臨床上可用于治療輕重度±s)VD[13]。本實驗證明,補陽還五湯和尼莫地平都可改善VD大鼠學習記憶能力,且補陽還五湯組優于尼莫地平組,補陽還五湯能明顯減輕缺血對海馬的損傷,保護神經元,提高VD大鼠Morris水迷宮成績,這可能是其增強學習記憶的機制之一。但對其改善學習記憶能力的機制值得進一步探討。

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