通脈大生片對腎虛排卵障礙型不孕大鼠 IGF-1及其受體影響的研究*

黃金珠 方云蕓 傅春華 成都中醫藥大學科技處(成都 611137)

通脈大生片是成都中醫藥大學第一附屬醫院用于婦科臨床 50余年的重點院內制劑。該方來源于著名中醫學家卓雨農老先生自制方“通脈大生丸”,由紫河車、肉蓯蓉、杜仲等 17味中藥組成 ,具有溫腎填沖,調補氣血,通暢脈絡等作用,在腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥等方面取得較好的臨床療效。本實驗主要研究通脈大生片對排卵障礙型大鼠的的胰島素生長因子-1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)的影響,以期證明用溫腎填沖,調補氣血,通暢脈絡的中醫方藥對腎虛、沖任虛損所致的排卵障礙、黃體功能不健的不孕癥有較好的臨床價值。

1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 動物:健康 9日齡 SD系雌性大鼠,出生后母鼠哺乳至 22日齡斷奶,專人飼養。利用自然光照,室溫維持在 20～25℃ ,動物和飼料均由成都中醫藥大學實驗動物中心提供,SD大鼠批號為:SCXK(川)2008-11。

1.1.2 試劑及儀器:丙酸睪丸酮注射液(規格:1m L:25mg)天津金耀氨基酸有限公司生產,國藥準字 H12020531;通脈大生片(由杜仲、續斷、桑寄生、肉蓯蓉、紫河車、茯苓、山藥等組成),規格:0.3g/粒,成都中醫藥大學院內制劑,川藥制字Z20070648;枸櫞酸氯米芬片 (規格:50mg/片)賽普路斯企業生產,進口藥品注冊證號:H20040352;大鼠胰島素生長因子-1(IGF-1)酶聯免疫分析試劑盒,批號:DEZ30653,由 RD公司提供;胰島素生長因子-1R(IGF-1R)一抗 bs-0680R,由博奧森公司提供,IGF-1R二抗 sp-9001兔抗,由中杉金橋公司提供,批號:511783 A。可調式移液器:美國 PALL-Gelman公司;全自動多功能酶標儀 MK 3:芬蘭雷勃。ILDZ4-018離心機:北京醫用離心機廠。783643型光學顯微鏡為日本O LYMPUS公司生產;BI2004圖像分析系統儀由成都泰盟科技有限公司提供。

1.2 方 法 1.2.1 模型復制及分組方法:應用SPSS13.0統計軟件包產生的隨機數字表,將 66只 9日齡 SD雌性大鼠隨機分為空白對照組,模型組,通脈大生片高劑量組,通脈大生片中劑量組,通脈大生片低劑量組,克羅米芬對照組,共 6組。參照俞瑾等[1]研究方法,于實驗組和模型組頸背部皮下注射丙酸睪丸酮 1.25mg/只 (0.05m L/只)。正常組在同等條件下飼養,未作特殊處理,第 22日齡斷奶,利用自然光照,室溫維持在 20℃左右 ,并由專人在同樣條件飼養。第 70日齡(大鼠體重約 150g左右)陰道開口。連續陰道涂片 2個性周期(1個性周期為 5d),觀察其陰道上皮細胞有無性周期變化,陰道上皮無性周期變化,則提示無排卵大鼠模型制作成功。

1.2.2 給藥方法:從第 80d開始 ,各組分別按如下方法給藥,按臨床用藥,以 60 kg人為標準,按照體重—劑量換算法計算大鼠給藥劑量。模型組和正常組給 1m L(100g? d)生理鹽水灌胃;通脈大生片高劑量組給予 0.12g/m L(100g? d)灌胃;通脈大生片中劑量組給予 0.06g/m L(100g? d)灌胃;通脈大生片低劑量組給予 0.03g/m L(100g? d)灌胃;克羅米芬組給予0.83mg/m L(100g? d)灌胃,每天灌胃 1次,連續灌胃 5周后股動脈取血處死大鼠。

1.2.3 檢測方法:陰道脫落細胞檢查:給藥 25d后,對大鼠進行陰道涂片。將無菌棉簽用生理鹽水浸濕后輕輕插入大鼠陰道內,順時針旋轉 1圈充分沾取分泌物后,在載玻片上同方向輕輕滾動 3次,使分泌物均勻地涂布于載玻片上,待涂片自然晾干后,用 95%乙醇固定 15m in后,采用巴氏染色法,在顯微鏡下觀察并判定其性周期,以判定造模的成功與否;連續灌胃 5周后,股動脈取血并處死大鼠,取出的血在室溫下靜置 2h后,用轉速 3000轉/分離心 10min取其上清液,用酶聯免疫法檢測血清中 IGF-1的濃度,取出卵巢,小心剔除脂肪組織,并包埋、切片,用免疫組化檢測卵巢中 IGF-1R,剔除脫片,組織重疊,切到脂肪組織及輸卵管的切片,在 400倍電鏡下采用同一光線,每系統分析其積分光密度。病理切片用 HE染色,在 100倍光鏡下觀察其形態學變化。

1.2.4 統計學方法:應用 SPSS 13.0統計軟件分析,多樣本之間均數比較采用單因素方差分析(one way ANOVA),用±s表示。

2 結 果 2.1 對卵巢的病理形態學觀察結果 鏡下模型組卵巢蒼白,表面見卵泡,但卵泡多呈囊性擴張,卵泡內含大量漿液性物質,間質過度增生,有大量閉鎖卵泡和原始卵泡存在,無成熟卵泡,卵泡較小,無黃體;給藥組卵巢色澤鮮紅,與模型組比較,病理性囊性卵泡明顯減少,卵泡壁顆粒細胞排列較密,層次增多,有少量成熟卵泡和黃體生成;正常組卵巢色澤紅潤,卵泡發育良好,無病理性囊性卵泡,有成熟卵泡,表面見較多黃體。

2.2 各組間 IGF-1水平比較

表1 各組間 IGF-1水平統計結果比較

2.3 各組間 IGF-1R表達結果比較

表2 各組間 IGF-1R表達統計結果比較

3 討 論中醫認為排卵障礙以腎虛為關鍵,內經云“腎藏精,主生殖,為先天之本”。卵子是腎所藏之“陰精”,腎陰是其物質基礎,腎陽是其生長的動力。腎精充盛是卵子發育成熟的前提,腎陽保障腎在排卵前只合不開,發揮主蟄與主閉藏之功能,使腎藏精而不泄,腎精充盛,卵子發育成熟,陽氣主動,腎陽的鼓動使沖任氣血調暢,卵子正常排出。若腎精不足、腎陽虧虛,一方面當合不合,卵泡不能發育成熟,另一方面,當開不開,不能作為內在動力鼓動卵子排出,從而出現卵子排出障礙。行,沖任脈絡不暢,阻滯胞宮胞脈,也會導致卵子排出受阻。故卵子的發育成熟及排出與腎精充盛、腎陽鼓動密切相關。故中醫治療常以補腎為主,兼調補沖任氣血,效果顯著。

而通脈大生片是由杜仲、續斷、桑寄生、肉蓯蓉、紫河車、茯苓、山藥、枸杞、首烏、臺烏、當歸、荔枝核、車前仁等十七味中藥組成,方中用紫河車、肉蓯蓉、杜仲、續斷溫補腎陽,血肉有情之品直入下焦 ,填奇經之精,補奇經之氣;配以枸杞子、首烏、當歸養肝陰,補益奇經之血;輔以山藥、茯苓、車前仁、桑寄生健脾利濕,調理脾胃,當歸、臺烏、荔枝核活血行氣,通其脈絡 ,共奏通補之效。全方具有溫腎填沖,調補氣血,通暢脈絡的作用。

現代研究發現卵巢排卵,既受下丘腦-垂體-卵巢軸的調控,也受卵巢局部微環境特別是非固醇網絡的調控,即卵巢的自分泌-旁分泌系統在卵巢局部發揮微調節作用。參與這一過程的自分泌和旁分泌因子很多,其中胰島素生長因子-1(IGF-1)已被證實參與卵巢的局部調節[2-4]。

自從 1978年 Rinderknek t和 Humbel首先純化 IGF-1和IGF-2后 ,人們發現卵巢可以產生 IGFs,而 IGFs可以獨立或協同促性腺激素調節卵巢周期性優勢卵泡選擇、排卵、性激素合成等。目前研究認為介導胰島素生長因子家族的生理功能的主要是 IGF-1和 IGF-1R發揮的[5,6],且 IGF-1是卵巢局部調節系統中重要的生長因子[7-8],IGF-1除可刺激黃體顆粒細胞產生E2和 P,還可以協同 LH進一步促進雄激素的合成和分泌,使雄激素水平升高[9]。因此,卵巢內 IGF-1的過度表達,可導致雄激素合成過多,進而導致卵泡過早發育、卵泡膜過度增生,成為不易破裂的囊泡,進而影響卵泡的成熟和排卵。IGF-1R在卵巢顆粒細胞、卵泡膜細胞和黃體細胞中均含有。原位雜交表明,IGF-1Rm RNA主要在顆粒細胞和卵母細胞中表達。在大鼠中,經 IGF-1處理培養的大鼠顆粒細胞能夠提高 1型 IGF受體的表達[10]。 IGF-1的大部分細胞效應通過 IGF-1R實現[11]。

本研究發現模型組血清內 IGF-1水平以及卵巢局部 IGF-1R的表達明顯高于正常組。該結果提示 IGF-1/IGF-1R過高可以導致排卵障礙,而通過給藥,高劑量通脈大生片可降低大鼠血清內 IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R表達,低劑量通脈大生片可降低 IGF-1R的表達。說明通脈大生片可以通過降低 IGF-1/IGF-1R促進卵泡的生長發育和排出。而克羅米芬并不能降低血清 IGF-1水平和卵巢局部 IGF-1R的表達,提示克羅米芬促排卵的機制可能不是通過調節 IGF-1/IGF-1R起作用的。同時,在本實驗中發現中劑量通脈大生片對過高的 IGF-1/IGF-1R不敏感,考慮可能與給藥濃度、樣本量、給藥時間等因素有關。而通脈大生片是如何達到降低 IGF-1/IGF-1R,是通過性腺軸,還是有其它因子的參與,需進一步深入研究。

[1] 魏美娟,俞 瑾.雄激素致高胰島素與高雄激素性無排卵大鼠模型[J].生殖醫學雜志,1993,2(4):216.

[2] 陳芷玲.調經促排助孕湯治療無排卵性不孕癥 32例[J].實用中醫雜志,2002,18(4):14.

[3] 王志俊.255例不孕癥臨床觀察 [J].新中醫,1995,27(5):37-38.

[4] 王奎武,李 娜,杜 平,等.李廣文教授治療無排卵性不孕癥 54例經驗 [J].河南中醫,1995,15(3):154.

[5] Rubin R.Basrega.Insulin-like grow th factor-I receptor.Its roles incell proliferation.apoptosis.,and tumorigenicity.Lab Invest 1995,73(3):311-331.

[6] Yu H,Rohan T.Role of insulin-like grow th factor fam ily in cancer development and p rogression.JNatl Cancel Inst 2000,92(18):1472-1489.

[7] 夏 天,沈 嶸,侯莉莉,等.補腎調沖方對大鼠卵巢顆粒細胞增殖與分泌及其 IGF-1 m RNA表達的影響 [J].遼寧中醫雜志,2006,33(9):1084.

[8] GintherOJ,Bergfelt DR,BegM A,et al.In vivo effects o f an intrafollicular injection o f insu lin-like grow th factor onthemechanismo f follicledeviation inheifers andmares[J].Biol Rep rod,2004,70(1):99.

[9] 王治鴻.多囊卵巢綜合征高雄激素血癥的形成[J].國外醫學?婦產科學分冊,2001,28(3):167.

[10] deM oura M D,Chamoun D,Resnick CE.Insu linlike grow th factor(IGF)-Istimu lates IGF2-Iand type 1 IGF receptorexpressioninculturedratgranulosacell:autoc rineregu lation of the intrafo llicu lar IGF2-I system.Endocrine,2000,13:103-110.

[11] Barnes RB,Namnoum AB,Rosenfield RL,etal.The role of LH and FSH in ovarian and rogen sec retion and ovarian follicular development:clinical studies in a patient with isolated FSH deficiency and malticyatic ovaries[J].Hum Rep rod,2002,17:88-91.