白芍總苷對 CIA大鼠血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10及關節浸液 NO和 PGE2影響的研究*

李宜川 張玉霞 劉國玲 高明燦 常景芝 沈永杰 陳曉琦

河南商丘醫學高等專科學校生物化學教研室(商丘 476100)

類風濕性關節炎(Rheumation Arth ritis,RA)是以關節滑膜慢性炎癥為主要表現的自身免疫性疾病,其顯著的病變以滑膜組織炎性細胞浸潤、滑膜細胞增生、血管翳形成和軟骨及軟骨下骨質破壞為主要病理表現。RA的發病機制涉及細胞因子、遺傳、感染等多種因素,其中細胞因子網絡失衡在 RA的發生、炎癥遷延、關節的破壞中占有重要的地位[1]。白芍總苷(total glucosides of paeonia,TGP)是從亳白芍干燥根中提取的有效成分,主要為糖苷類物質,具有多途徑抑制自身免疫反應,以及抗炎、止痛、抗應激等作用。本實驗在成功地建立膠原性關節炎(co llagen-in-duced arth ritis,CIA)大鼠模型的基礎上,觀察 TGP對 CIA大鼠的治療作用,通過檢測大鼠血清中LI-1β、 TN F-α、IL-4和 IL-10水平及關節浸液中 NO和 PGE2含量,探討 TGP對 CIA大鼠治療的可能機制,為臨床使用TGP治療 RA提供新的實驗依據。

1 材料與方法 1.1 材料 TGP:購于安徽醫科大學臨床藥理研究所;弗氏完全佐劑、雞Ⅱ型膠原(chicken type II collagen,C II):上海本草生物醫學工程所提供;多聚賴氨酸:Sigma公司;地塞米松鹽酸注射液 (5mg/m L):河南確山龍淵藥家莊四藥股份有限公司;LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10試劑盒 RD公司;NO試劑盒:南京建成生物工程研究所;PGE2試劑盒、:解放軍總醫院科技開發中心放免所;酶標免疫測定儀:Bio-Rad公司;80-2型離心機:蘇州威爾實驗用品有限公司。

Sp rague-Daw ley(SD)大鼠 60只 ,雌雄各半 ,質量 (180±20)g左右,動物中心提供,合格證號:2010A01。

1.2 方 法 1.2.1 實驗動物分組:實驗用大鼠按統計學方法隨機分為 6組:A正常組對照組,B模型對照組,C地塞米松組(2mg/kg),D白芍總苷小劑量組(25mg/kg),F白芍總苷中劑量組(50mg/kg),E白芍總苷大劑量組(100mg/kg)。每組 10只。

1.2.2 CIA大鼠模型的制作及給藥方法:將雞Ⅱ型膠原15mg制成穩定的乳化劑 15m L,每 m L含 1.0gⅡ型膠原,置4℃冰箱保存備用。SD大鼠,除正常對照組外,以 0.1m L/只的劑量在鼠的左后肢足跖皮內注射膠原乳劑致炎,第 7d在大鼠尾、背多點皮內注射 0.1m L該膠原乳劑作為激發注射。正常對照組注射等劑量生理鹽水作為致炎物質。于造模后第 7～27d各用藥組灌胃給藥,1次 /d,正常對照組和模型組用等容積生理鹽水灌胃。

1.2.3 血清細胞因子測定:實驗第 36d向 CIA大鼠腹腔內注射 3%巴比妥那 0.3～ 0.4m L使之麻醉。剪開大鼠腹腔,心臟取血,3000rpm離心 15m in,吸取上層血清。用 ELISA法 (按試劑盒說明書進行操作)測定 CIA大鼠血清中 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10含量。

1.2.4 關節浸液 NO和 PGE2的測定:大鼠處死后,迅速在左足摘取腫脹足爪,縱向切開足爪組織,放入冷生理鹽水中,于 4℃浸泡過夜,離心取上清液過濾除菌。NO含量的測定采用硝酸還原法,PGE2含量測定采用放免法,均按試劑盒說明進行操作。

1.2.5 統計學方法:數據分析用 SPSS11.5軟件處理,數據以 x-±s表示,計量資料的組間顯著性檢驗采用單因素方差分析。

2 結 果 2.1 TGP治療前 CIA大鼠各組血清 LI-1β、TN F-α、IL-4和 IL-10水平比較造模后,TGP給藥治療之前,CIA大鼠血清 LI-1β、TNF-α水平較正常組大鼠異常增高(P＜0.01),IL-4和 IL-10含量有所下降,但與正常組大鼠比較無顯著性差異(P＞ 0.05),見表1。

表1 治療前 CIA各組大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較,(pg/m L,n=10±s)

表1 治療前 CIA各組大鼠 LI-1β、TNF-α、IL-4、IL-10水平比較,(pg/m L,n=10±s)

注:各組與正常組比較,△P＜0.01。

正常對照組13.28± 3.4514.21± 6.529.20± 0.7932.86± 6.11模型對照組33.16±4.12△32.98± 6.87△7.73±1.1231.10±4.12 2mg/kg的地塞米松組32.65±4.10△32.58± 3.46△8.30±1.8830.43±1.52 25mg/kg白芍總苷組33.89±5.13△33.19± 1.87△8.41±1.4430.63±3.89 50mg/kg白芍總苷組31.73±4.37△33.15± 4.89△7.76±1.8931.47±2.86 100mg/kg白芍總苷組33.13±3.98△32.88± 1.15△7.69±2.1030.88±3.12

表2 TGP治療后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平與 CIA對照組的比較,(pg/m L,n=10,±s)

表2 TGP治療后血清 LI-1β、TNF-α、IL-4和 IL-10水平與 CIA對照組的比較,(pg/m L,n=10,±s)

注:與模型組比較,△P＜0.01。

組 別LI-1βTNF-αIL-4IL-10模型對照組34.28± 5.7631.78± 4.737.51.± 1.7824.12± 3.57 2mg/kg的地塞米松組22.48±3.16△22.43± 5.44△33.12±2.10△49.88±8.45△25mg/kg白芍總苷組33.49± 4.8830.10± 2.118.48± 4.3425.44± 6.87 50mg/kg白芍總苷組24.36±5.66△23.62± 4.23△33.22±3.18△50.22±2.78△100mg/kg白芍總苷組23.39±4.32△25.46± 1.53△32.20±2.33△51.41±2.43△

2.2 TGP治療后血清 LI-1β、 TN F-α、 IL-4和 IL-10水平與 CIA大鼠對照組的比較 TGP(50,100mg? kg-1)組及地塞米松(2mg? kg-1)組治療后 CIA大鼠血清 LI-1β和TN F-α水平明顯降低,IL-4和 IL-10水平明顯上升,與 CIA大鼠模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01),見表2。

2.3 TGP對 CIA大鼠關節浸液內 NO和 PGF2含量的影響 與正常組比較模型組大鼠關節浸液中 NO和 PGE2含量明顯增高 (P＜0.01);TGP(50,100mg? kg-1)組、地塞米松(2mg? kg-1)組和 TGP(25mg? kg-1)組治療后關節浸液內NO、PGE2含量下降,與模型組大鼠比較有顯著性差異 (P＜0.01,P ＜ 0.05)。 見表3。

表3 白芍總苷對 CIA大鼠關節浸液內 NO和PGF2含量的影響,(n=10,±s)

表3 白芍總苷對 CIA大鼠關節浸液內 NO和PGF2含量的影響,(n=10,±s)

注:與正常組比較 ,△P＜0.01;與模型組比較▲P＜0.01,◇P ＜0.05。

正常對照組19.88±8.598.87± 6.46模型對照組47.25±7.22△32.77±9.88△2mg/kg的地塞米松組30.12± 11.46▲15.13±2.16▲25mg/kg白芍總苷組37.22± 12.10◇20.11±1.16◇50mg/kg白芍總苷組28.42± 11.31▲15.66±3.44▲100mg/kg白芍總苷組26.88±2.19▲14.18±6.23▲

討 論 RA病因和病理機制還不十分明確,但越來越多的證據表明,細胞因子在 RA的病理過程中發揮著重要作用[2]。TN F-α是由 Mф衍生的細胞因子,具有多種促炎作用,在滑膜細胞培養液中 TNF-α可刺激膠原酶和前列腺素 E的產生,導致軟骨和骨骼損害[3],TN F-α還能上調粘附分子在血管內皮細胞的表達和其它炎性細胞因子如 LI-1β、LI-6和 GM-CSF等的產生[4]。 IL-1β可誘導 RA關節滑膜細胞增殖,刺激滑膜細胞產生蛋白激酶,增強 TN F-α和 IL-6的效應。 IL-10是一種天然的免疫抑制劑,可減少致病性促炎性細胞因子和趨化因子,抑制LI-1β和 TN F-α的產生,IL-10還能夠抑制基質金屬蛋白酶的表達及提高金屬蛋白酶組織抑制因子的表達,從而產生對軟骨細胞的保護作用。 IL-4由 T細胞衍生,可阻礙破骨細胞前體轉化為破骨細胞,降低破骨細胞活力,抑制其存活。本實驗結果證實,CIA大鼠血液 LI-1β、TN F-α水平升高,TGP治療后血液LI-1β和 TNF-α含量均明顯下降,水平低下的 IL-4和 IL-10含量側明顯升高,提示 TGP可能通過直接或間接作用降低 LI-1β和 TNF-α的產生 ,提高血液 L-4和 IL-10含量,從而對 CIA大鼠發揮治療作用。

RA動物實驗性關節炎時 ,體內 NO水平異常升高,特別是關節浸液中有大量 NO[5]。作為一種重要炎癥介質 NO損害關節的機制是促進 PGE2、LI-1β和 TN F-α等炎癥介質的釋放,導致血管過度擴張、滲出增多[6]。本實驗研究發現 CIA大鼠關節浸液中 NO和 PGE2含量明顯增高;TGP治療后 CIA大鼠關節浸液中 NO和 PGE2水平顯著低下。提示 TGP可通過抑制關節浸液 NO和 PGE2產生,減輕局部炎癥,改善關節腫脹等癥狀。

綜上所述,TGP對 CIA大鼠的多發性關節炎其機制可能是 TGP抑制 CIA大鼠內源性細胞因子 (LI-1β和 TN F-α)活性和炎癥局部區域相關炎癥介質(NO和 PGE2)產生,同時提高抑炎細胞因子(L-4和 IL-10)含量,誘導炎性細胞因子網絡趨于平衡,從而對 CIA大鼠發揮治療作用。

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