PCR引物濃度對寡核苷酸液相雜交的影響

李義良，易進華，夏佳慧，周文艷，范麗麗

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PCR引物濃度對寡核苷酸液相雜交的影響

李義良，易進華，夏佳慧，周文艷，范麗麗

201210 上海復旦張江生物醫藥股份有限公司

考察 PCR 引物濃度配比對液相微珠雜交效率的影響，尋求具有較強雜交信號和較好穩定性的 PCR 引物濃度配比。

建立 HLA-DRB1 等位基因的相關數據庫，選擇在 HLA-DRB1 位點的第二外顯子上設計探針，并且選擇其保守序列作為陽性對照探針（DPC2），DPC2 探針中間位點 T 突變成 A 作為陰性對照探針（DNC）。分別針對標本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設計出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針，各探針 5’ 端用氨基（NH2）修飾。通過引物濃度梯度配比（1:100、1:50、1:20、1:8、1:4、1:2、1:1），對型別已知的細胞株 DNA 進行 PCR 擴增并得到目的片段（1:100 配比除外），在相同條件下將 PCR 產物與寡核苷酸探針進行液相雜交檢測。

濃度配比為 1:1 的對稱式擴增產物雜交結果不理想，而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對稱擴增均得到了待檢單鏈、雙鏈 DNA 混合物，其中 1:4 濃度配比具有最好的擴增效率和穩定性。根據陽性信號與陽性標本是否相符表明：引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 檢測效果差，易出現假陰性；1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測效果較好，比較穩定。

PCR 引物濃度配比影響液相微珠雜交效率，不對稱 PCR 產物有利于提高雜交效率，為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎，有利于寡核苷酸液相芯片的應用。

聚合酶鏈反應； 寡核苷酸序列分析； 核酸雜交

液相芯片是 20 世紀 90 年代中期發展起來的，以美國 Luminex 公司的 xMAP（flexible multi- analyte profiling）技術為基礎，既能保證信息質量，又能提供相對高通量的新一代分子檢測技術平臺[1-2]。xMAP 液相芯片體系由許多不同顏色的微珠為主要基質構成，每種微珠表面共價連接有不同的寡核苷酸探針分子，將這些微珠懸浮于一個液相體系中，就構成了一個液相芯片系統。雜交在懸浮的液相中進行，空間位阻小，所需反應時間短，雜交后不用清洗就可以直接讀數，檢測效率大大高于固相雜交。xMAP 液相基因芯片已廣泛應用于單核苷酸多態性分析[3]、組織相容性抗原分型[4]、基因表達分析等[5]研究，可實現高通量檢測。目前寡核苷酸間的分離和雜交過程已被進行了較深入的研究[6-7]，但仍有很多問題亟待解決。影響寡核苷酸液相芯片雜交效果的因素有很多，樣品制備是其中一重要影響因素。傳統對稱 PCR，擴增所得產物為雙鏈 DNA，不經過堿變性或熱變性，無法同寡核苷酸探針雜交。即使通過變性步驟后，雜交效率也比較低。而且，DNA 雙鏈間的復性作用力要遠遠強于核酸與寡核苷酸探針間的雜交作用力，造成雜交信號較弱或不穩定。用單鏈進行雜交被認為是排除雙鏈干擾、得到理想雜交結果的較好方式[8-10]。

不對稱 PCR 由 Gyllensten 和 Erlich[11]在 1988 年首次提出，常被用于獲得單鏈 DNA，目前文獻一般認為其限制性引物和非限制性引物濃度最佳配比為 1:50 ~ 1:100，擴增效率較低、不穩定、難以優化并且容易產生非特異性擴增。研究表明，相對于傳統對稱 PCR，不對稱 PCR 擴增效率只有 60% ~ 70%，而前者可達到 90%，甚至更高[12-13]。此外，還需要控制引物和模板數量，因而，往往不能保證每次不對稱 PCR 擴增都獲得成功。如兩條引物濃度相差太大，限制性引物濃度太低，其對稱擴增效率也會大大降低。

本文比較了 PCR 引物濃度配比對寡核苷酸液相雜交的影響，尋求具有一定擴增效率，能獲得較強的雜交信號和穩定性的引物濃度配比，以便于建立成功率較高的 PCR 試劑配制標準操作程序，促進寡核苷酸液相芯片的 SNP 檢測和臨床應用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標準 DNA HLA 基因型別已知 DNA 標本：C2-008、C2-024、C2-025 購于美國 UCLA（University of California，Los Angeles）免疫遺傳學中心，濃度 50 ng/μl，純度 OD260/280 1.65 ~ 2.0。標本相應基因型詳見表 1 中陽性標本列。

表 1 寡核苷酸探針序列及對應陽性標本

1.1.2 試劑與微珠 Taq DNA 聚合酶為上海博彩公司產品；鏈親素修飾的藻紅蛋白 PJ31S （StreptavidinR-phycoerythrin，SAPE），2.02 mg/ml，購于美國 Prozyme 公司；雜交液為上海復旦張江生物醫藥股份有限公司產品；羧基修飾的聚苯乙烯熒光微珠 L100-C103、L100-C105、L100-C107、L100-C113、L100-C130、L100-C197 為美國 Luminex 公司產品。

1.1.3 主要儀器 多功能懸浮點陣儀 Luminex- 100TM購自美國 Luminex Corp 公司；9700 PCR 儀購自美國 ABI 公司；EPS 3500 電泳儀和凝膠成像儀均購自美國 Pharmacia 公司；5810R 型平板離心機購自德國 Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 雜交微珠制備方法

1.2.1.1 引物與探針的設計、合成與標記 參照文獻[4]，并檢索 Genbank（http://www.ncbi.nlm.nih. gov）以及 EMBL（http://www.ebi.ac.uk）數據庫中的 HLA-DRB1 基因序列進行整理，建立了 HLA- DRB1 等位基因的相關數據庫。HLA-DRB1 基因的第二外顯子的 PCR 引物序列為：上游引物 P1（5’ CCGGATCCTTCGTGTCCCCACACG 3’），下游引物 P2（5’ CCGCTGCACTGTGAAGCTCTC 3’）。下游引物 P2 的 5’ 端進行生物素標記。

根據 HLA 等位基因的變異特點，選擇在 HLA-DRB1 位點的第二外顯子上設計探針，并且選擇第二外顯子上的保守序列作為陽性對照探針（DPC2），DPC2 探針中間位點 T 突變成 A 作為陰性對照探針（DNC）。分別針對標本 C2-008、C2-024、C2-025 的等位基因序列設計出 6 條約 21 bp 的寡核苷酸探針，各探針 5’ 端用氨基（NH2）修飾。上述引物和探針由上海生工生物工程技術有限公司合成。表 1 為寡核苷酸探針具體序列及對應成陽性反應的標本。

1.2.1.2 探針耦聯 ①耦聯條件：0.1 mol/L的（N-嗎啡基）乙磺酸（MES）（pH 4.5），50 μl；0.1 nmol 氨基修飾寡核苷酸探針；2.5 × 106個羧基修飾熒光微珠（不同顏色編號），加入 2.5 μl 40 mg/ml 的 1-乙基-（3-二甲基-丙烷）氫氯化二亞胺（EDC）作為催化劑，混合后室溫條件下孵育 30 min（第 15 分鐘時渦漩混勻一次），然后加入新鮮配制的 EDC 溶液 2.5 μl，室溫條件下孵育 30 min；加入 1 ml 0.02% 吐溫–20，上下顛倒搖勻洗滌，13 000 r/min 離心 2 min，吸除上清；加入 1 ml 0.1% SDS（十二烷基硫酸鈉），重懸 Beads，上下顛倒混勻洗滌；12 000 r/min 離心 2 min，吸除上清；50 μl Tris-EDTA緩沖液（pH 8.0，NaN3）重懸 Beads，渦漩混勻，4避光保存備用。

②質檢：選取型別已知，針對各探針反應結果均有陰性和陽性的不同標本作為質控標本，雜交檢測，探針表現和理論一致，陽性、陰性對應出現，則表明耦聯成功，質檢合格。

1.2.1.3 微珠的制備 探針耦聯質檢后混合，使每種編號微珠數量為 5 000 個/μl，組成液相雜交微珠。

1.2.2 樣品的制備

1.2.2.1 對稱 PCR 擴增 ①反應體系：模板DNA 2 μl（50 ng/μl），P1、P2 引物量均為 0.4 μmol/L，Taq DNA 聚合酶 0.2 μl（5 U/μl），10′Buffer 2 μl，加雙蒸水 dd H2O 至終體積 20 μl。②PCR 反應條件：96 ℃，3 min；96 ℃，20 s，60 ℃，20 s，72 ℃，20 s，5 個循環；然后 95 ℃，10 s，60℃，15 s，72 ℃，20 s，35 個循環；再 72 ℃延伸 10 min。每一樣品分別做 3 個平行擴增反應。

1.2.2.2 不對稱 PCR 擴增 固定下游引物 P2 量為0.4 μmol/L，提高引物 P1:P2 比例至 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50 和 1:100。PCR 反應循環條件同對稱 PCR 條件，每一樣品分別做 3 個平行擴增反應。取其中一批兩種方式 PCR 擴增產物各5 μl，用含有溴乙錠的 3%瓊脂糖凝膠進行電泳后觀察結果。

1.2.3 芯片雜交及清洗 雜交體積為 20 μl：每孔加 5 μl PCR 擴增產物，15 μl 雜交混合液[耦聯好探針的微珠混合液 2 μl，13 μl 1.5′雜交液（4.5 mol/L氯化四甲基銨（TMAC），75 mmol/L Tris，4 mmol/L EDTA，0.15% Sarkosyl 月桂酰-N-甲基氨基乙酸鈉，pH 8.0）]。將雜交板用膜密封好后，低速充分震蕩混勻，PCR 儀 97 ℃變性 7 min，60 ℃孵育 15 min；從 PCR 儀上取下雜交板，每孔立即加 100 μl 的洗滌液（WB），覆膜，離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min，取出雜交板，迅速甩掉上清液，然后倒置在吸水紙上，去除雜交板面上殘余的液體。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮，每孔加入 120 μl WB，覆膜，離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min（期間準備 1′PJ31S 熒光蛋白溶液，把 PJ31S 濃縮液 250 倍稀釋于 1′雜交液中）；取出雜交板后，迅速甩掉上清液。震蕩混勻直至白色沉淀完全懸浮，每孔加 20 μl 的 1′PJ31S，覆膜，密封后，低速震蕩充分混勻。PCR 儀60 ℃孵育 6 min；從 PCR 儀上取下雜交板，每孔立即加 100 μl 的 WB。離心半徑 18 cm，3 000 r/min 離心 5 min。甩掉洗滌液，每孔加 75 μl 的 WB，吹打混勻后轉移到讀板上。

1.3 數據處理

Luminex 100 儀器讀取標本，收集數據。轉化成標準化值（T 值），雜交檢測標準化值 T：T =（MFIProbe－MFIDNA）/（MFIDPC2－MFIDNA）× 100。陽性信號的判斷標準為：熒光強度 > 1000，熒光強度標準化值明顯大于陰性標本對應的標準化值，其比值> 3，否則為陰性。

2 結果

2.1 引物濃度梯度配比 PCR 擴增產物

引物濃度梯度配比 PCR 產物電泳，結果如圖 1 所示。PCR 擴增產物目的片段的大小為 288 bp，引物濃度配比 1:100（0.004 μmol/L:0.4 μmol/L）、1:50（0.008 μmol/L:0.4 μmol/L）均有較亮的非特異性擴增條帶，前者未觀察到目的片段，后者目的條帶也很弱。對稱 PCR（1:1 配比，0.4 μmol/L:0.4 μmol/L）產物雙鏈 DNA 片段最亮，但未觀察到單鏈 DNA，其他配比均有效擴增出目的片段，為雙鏈 DNA 和單鏈 DNA 混合物，且隨著濃度不對稱配比的縮小，電泳條帶亮度逐漸增加，但0.1 μmol/L:0.4 μmol/L 配比的 PCR 產物單鏈 DNA 條帶最亮，同時也獲得了較亮的雙鏈 DNA，具有最好的擴增效率和穩定性。

2.2 引物濃度配比對液相微珠雜交結果的影響

為避免實驗數據隨機性，PCR 擴增時，每個樣品做 3 次平行考察。在相同條件下將所得擴增產物與寡核苷酸液相微珠進行雜交檢測，得到相關平均值（具體每個平行孔檢測數據未顯示），如圖 2A、2B 所示。圖 2 中a、b、c 對應標本依次為 C2-008、C2-024、C2-025，其中圖 2A 為不同引物濃度配比 PCR 產物雜交后熒光強度均值比較，引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 時，各標本對應陽性探針熒光值均明顯低于其他配比雜交結果，小于 1 000（C2-024 標本中 PD05 探針除外）。其中 1:20 配比檢測結果熒光值最高，1:8、1:4、1:2 配比檢測結果熒光值接近。圖 2B 為雜交后熒光強度標準化值比較，引物濃度配比為 1:1 時，標本對應陽性探針其標準化值均明顯低于其他配比的雜交結果，其中在 C2-024 和C2-025 標本中，探針 PD13 標準化值與其陰性標本 C2-008 中的標準化值很接近，未見有陽性熒光信號（假陰性），探針 PD05 與 PD07 陽性也明顯降低。引物濃度配比為 1:100 時，陽性探針標準化值最大，但由于內對照陽性探針 DPC2 熒光值很低，故整體結果不理想。其他配比探針陽性標準化值接近，比較穩定。

圖 1 PCR 擴增產物電泳比較

Figure 1 Comparison of amplification products by agarose gel electrophoresis

在同一條件下雜交檢測不同引物濃度配比所得擴增產物，各柱狀圖顏色表示不同引物濃度配比。標本分別為 a：C2-008；b：C2-024；c：C2-025。探針為陽性反應時用“+”號表示。

Figure 2 Oligo liquid-bead hybridization results obtained from different primer concentration ratios. [A: Indicate comparison of signal intensity (average products from three individual amplifications); B: Indicate comparison of standardized value of signal intensity]

根據陽性信號是否與陽性標本相符表明：引物濃度配比為 1:100 的不對稱 PCR 和 1:1 的對稱 PCR 檢測效果差，易出現假陰性；1:2、1:4、1:8、1:20 配比檢測效果較好，比較穩定。

3 討論

DNA 液相雜交較復雜，尤其當 PCR 擴增效率低或所得產物為雙鏈 DNA 時，導致許多拷貝數低的基因無法有效檢測，許多探針出現假陰性，檢測靈敏性和穩定性差。我們在試劑研發、配制生產過程中發現：同一序列引物，合成后按對稱 PCR 擴增質檢，檢測效果好，陽性信號強，但再次合成后按同一引物濃度配比進行對稱 PCR 擴增檢測，電泳觀察，目的片段大小正確，條帶很亮，但雜交檢測陽性信號很弱，按對稱 PCR 方式調整引物濃度，檢測結果也無改觀。按不對稱 PCR 方式調整引物濃度配比后，電泳條帶相對較弱，甚至很弱時也獲得了較好的檢測結果。因此，建立具有一定擴增效率，同時又能產生大量單鏈的 PCR 方法、提高液相芯片的重復性、可靠性和敏感性非常重要。

DNA 雙鏈中只有一條鏈可與芯片進行雜交反應，另一條鏈則作為干擾鏈存在。本研究結果與此一致：引物濃度配比為 1:1 的對稱 PCR 產物，電泳條帶雖很亮，但雜交后陽性探針（DPC2）熒光值很弱，較其他不對稱 PCR（濃度配比為 1:2、1:4、1:8、1:20、1:50）的熒光值偏低很多。在 C2-024、C2-025 標本中，探針 PD13 未見有陽性熒光信號，出現假陰性；對應 C2-025 標本，PD07 探針熒光值信號與陰性標本（C2-024）熒光值信號接近，也未見有明顯陽性熒光信號（假陰性）；C2-024 標本中，PD05 探針熒光值信號也明顯低于其他配比檢測到的熒光值信號。Wei 等[8]也觀察到：當引物濃度高于 0.63 μmol/L 時，隨著雙鏈 DNA 量的增加，雜交檢測的信號強度反而降低。對此現象很難找出具體原因，高濃度的雙鏈靶分子可能存在較高的自我退火比率，增加了雜交的競爭壓力，從而降低雜交效率。另外，微珠表面一定范圍內靶分子太多，可能造成空間擁擠，反而降低雜交效率，不易與探針雜交。我們在室溫下加入適量強堿反應15 min，使雙鏈變性，用適量醋酸中和再進行后續雜交檢測，但結果與熱變性結果一致：雜交對稱 PCR 產物，探針仍有假陰性出現（數據未顯示），可能在雜交過程中互補鏈仍會與探針競爭與靶鏈 DNA 的雜交，使反應體系中實際用于雜交的靶序列濃度降低，從而影響雜交效率。

不對稱 PCR 產物雜交檢測結果，均沒有假陰性情況出現，而且陽性信號較強、較穩定，用單鏈進行雜交可排除雙鏈干擾、得到理想雜交結果[8-10]。引物濃度配比為 1:100 時，標本對應陽性探針均很強，但由于內對照陽性探針 DPC2 熒光值很低，故整體結果不理想，不能采用。

綜上所述：對稱式擴增產物雜交結果不理想，而濃度配比分別為 1:20、1:8、1:4、1:2 的不對稱式擴增顯著地提高雜交效率，有利于寡核苷酸液相雜交微珠的應用。采用 1:4（0.1 μmol/L:0.4 μmol/L）引物配比進行不對稱 PCR 擴增，可保證一定的擴增效率和單鏈 DNA 的生成，配制 PCR 引物反應液時，可以此引物濃度配比為基準進行測試調整，為快速成功配制 PCR 試劑奠定了基礎。

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Effects of the primer concentration on the liquid-phase oligonucleotide hybridization

LI Yi-liang, YI Jin-hua, XIA Jia-hui, ZHOU Wen-yan, FAN Li-li

Author Affiliation: Shanghai Fudan-Zhangjiang Bio-Pharmaceutical Co., Ltd., 201210, China

This study investigated the impact of ratios of PCR primer concentration on the liquid-Bead hybridization efficiency to find appropriate ratio of primer concentration with a stronger hybridization signal and the hybrid stability.

Database of HLA-DRB1 alleles was established. Probes were designed according to the sequence of exon 2 of HLA-DRB1 locus. Conserved sequence were selected for positive control probe design (DPC2). Negative control probe was synthesized through a mutation from T to A in the middle of the sequence of DPC2. Six oligo probes about 21 bp were designed specially targeted to allele sequences from samples C2-008, C2-024 and C2-025 separately. The 5'-terminal sequences of each probe were modified by NH2. Genomic DNA from cell lines with known types was amplified with different ratios of primer concentration (1:100, 1:50, 1:20, 1:8, 1:4, 1:2, 1:1). Target fragments were obtained except from amplification with 1:100 ratio. PCR products were hybridized with oligonucleotide probes by liquid hybridization under same conditions.

Hybridization results from symmetric PCR products by concentration ratio of 1:1 are not satisfactory, while mixture of single-strand DNA and double-stranded DNA under test was obtained from asymmetric amplifications by ratios of 1:20, 1:8, 1:4, and 1:2, in which the best amplification efficiency and stability from the concentration ratio of 1:4. From the consistency of positive samples and positive signals, false negative results were common due to ratios of primer concentration 1:100 and 1:1.

The concentration ratio of PCR primers affects the efficiency of liquid-phase bead hybridization. Asymmetric PCR products help improve the hybridization efficiency. Our results established the foundation to prepare PCR reagents quickly and successfully in favour of liquid-phase oligonucleotide chip applications. Better results and stability would be expected using other ratios.

Polymerase chain reaction; Oligonucleotide array sequence analysis; Nucleic acid hybridization

LI Yi-liang, Email: yiliangli@yahoo.com.cn

李義良，Email：yiliangli@yahoo.com.cn

2009-11-23

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.02.008