遺傳背景對 2型糖尿病患者膳食干預效果影響的研究

孔令斌,房玉海,丁守華,楊志寅,卜志強,劉 東,陳 鵬

2型糖尿病 (T2DM)是由遺傳因素和環境因素共同作用導致的一類代謝異常綜合征。WHO報告顯示,1998年 DM居全球疾病死因順位的第六位,疾病負擔順位第三位,近年來其發病率急劇升高,而且其發病年齡日趨年輕化,已成為世界各國日益關注的公共衛生問題[1]。因此研究 T2DM發生的危險因素,對于實施有針對性的預防干預措施,延緩或防止 T2DM及其并發癥的發生、發展具有重要的臨床意義[2-5]。T2DM的病因復雜,并非由單一因素所致,遺傳、環境因素及不良生活方式和行為習慣在疾病的發生、發展過程中均起著非常重要的作用[6]。由于飲食模式影響機體的血糖、血脂的代謝,因此,采用各種有效的干預措施來降低血糖和血脂水平是目前許多國家 DM及心腦血管疾病防治工作的重點[7-8]。目前已有大量研究證實了以膳食干預為主的綜合干預措施的有效性,然而,在臨床上并不是每一位 T2DM患者經過膳食行為干預后都能夠取得滿意的效果,考慮可能與患者的遺傳背景有關[9]。因此,有必要探討基因多態性對 T2DM的發病及其治療干預措施的影響,為制定更為個體化的膳食干預對策提供科學依據,減少治療的盲目性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于 2003年 9月—2005年 9月在山東省梁山縣疾病預防控制中心糖尿病門診隨機抽取 378例自愿參加研究的新發 T2DM患者為研究對象,均符合 WHO 1999年糖尿病診斷標準[10]。檢測其脂蛋白脂酶 (LPL)基因 S447多態性,根據基因型分為兩組,一組為 LPL S/X+X/X基因型 (A組),另一組為 S/S基因型 (B組)。然后對兩組患者只進行飲食干預,干預時間為 2年,隨訪結束后,共隨訪到依從性強的T2DM患者 342例,隨訪率為 90.48%,其中 A組 60例,B組282例,檢測兩組患者的空腹血糖 (FPG)、血脂等指標并進行比較。干預前兩組患者的性別、年齡、血糖、血脂等指標間差別均無統計學意義 (P＞0.05,見表 1、2),具有可比性。

1.2 方法 取患者空腹肘靜脈血5 ml,將其中 3 ml血液當日分離血清,采用全自動血液生化分析儀檢測血糖、血脂;另外2 ml用 5%的 EDTA-Na2(1 ml血液加 20μl抗凝劑 ),用于基因組 DNA提取。(1)基因組 DNA抽提:低滲溶血法制備白細胞,苯酚氯仿抽提 DNA。(2)PCR擴增:以提取的 DNA為模板,利用設計的上、下游引物特異性擴增 LPL基因 S447位點的特異片段。引物序列為:上游引物 5′-TACACTAGCAATGTCTAGGTGA-3′;下 游 引 物 5′-TCAGCTTTAGCCCAGAATGC-3′。PCR反應總體積為 40μl,其中含 10×PCR Buffer 4μl,10 mmol dNTPs 0.8μl,上下游引物各8 pmol,Taq酶 3 U,膜板 3μl,加無菌去離子水至 40μl。取單份 PCR反應管,加入提取的基因組 DNA(或陽性質控品、陰性質控品)3μl,10 000 r/min瞬時離心 30 s。將各反應管做好標記,置入 PCR反應槽,按照下列條件擴增,循環條件:94℃變性 2 min,93℃退火 30 s,72℃延伸 30 s,共 35個循環,最后 72℃延伸 5 min。 (3)電泳檢測:取 PCR擴增產物 10μl,加 2 μl 6×Loading Buffer,加樣點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以 5 V/cm電壓,1×TAE中電泳,紫外燈下觀察結果,凝膠成像分析系統下拍照。

1.3 統計學方法 應用 SPSS13.0軟件進行統計學處理。計量資料用 (x±s)表示,采用 t檢驗,計數資料的比較采用 χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統計學意義。

表 1 干預前兩組患者的性別和年齡比較 (例)Table 1 The comparison of enumeration indexes between A group and B group before dietary intervention

2 結果

2.1 S/X及 X/X基因型患者膳食行為干預前后各項觀察指標的比較 LPLS/X及 X/X基因型患者在膳食行為干預后 FPG、腰臀圍比值 (WHR)及三酰甘油 (TG)水平降低,而體質指數 (BMI)、血清高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平升高,干預前后比較差別有統計學意義 (P＜0.01);血總膽固醇(TC)水平及收縮壓 (SBP)在干預前后差別無統計學意義(P＞0.05,見表 3)。

2.2 S/S基因型患者膳食行為干預前后各項觀察指標的比較LPL S/S基因型患者在膳食行為干預前后血脂水平及 BMI、WHR、SBP比較差別均無統計學意義 (P＞0.05),盡管干預前后 FPG水平差別有統計學意義 (P＜0.01),但 S/S基因型患者干預后 FPG平均水平仍處在非正常范圍內 (見表 4)。

2.3 膳食行為干預后不同基因型患者各項指標的比較 干預后 A組患者的 FPG、TG、BMI及 WHR低于 B組患者,HDLC水平高于 B組患者,差別均有統計學意義 (P＜0.05,見表5)。

表 2 干預前兩組患者的血糖和血脂等指標比較 (x±s)Table 2 The comparison of measurement indexes between A group and B group before dietary intervention

表 3 S/X及 X/X基因型患者膳食行為干預前后血糖和血脂等指標的比較 (x±s)Table 3 The comparison of indexes in patients with S/X and X/X genotype before and after intervention

表 4 S/S基因型患者膳食行為干預前后血糖和血脂等指標的比較 (x±s)Table 4 The comparison of indexes in patients with S/Sgenotype before and after intervention

表 5 膳食行為干預后兩組患者的血糖和血脂等指標比較 (x±s)Table 5 The comparison of indexes between patientswith differert genotypes after intervention

3 討論

LPL是水解脂蛋白中 TG的重要酶類,主要由脂肪細胞、心肌、骨骼肌等肝外實質細胞粗面內質網合成并分泌,釋放入血后,借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖結合在毛細血管內皮細胞上發揮其生理功能。活性形式為通過非共價鍵結合形成的同源二聚體,二聚體分離則脂解 TG的活性進行性喪失,其催化中心由 Ser132、Asp156、His241組成[11]。載脂蛋白 CⅡ (apoCⅡ)為 LPL的激活劑,載脂蛋白 CⅢ (apoCⅢ)則抑制其活性。LPL主要生理功能是水解血液中富含 TG脂蛋白中的三脂酰甘油,使其分解為甘油二酯和甘油一酯,釋放游離脂肪酸以供組織氧化分解并為機體提供能量,是清除血液中乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白 (VLDL)的限速酶。

LPL基因存在著多種變異方式,目前發現的多態性位點有Asp9Asn、Asn291Ser、Ser447Ter、PvuⅡ、HindⅢ、 BamHI、BstⅠ、BglⅡ、XbaⅠ等,LPL基因突變可導致其活性的變化,進而影響到其脂解功能。在以上基因位點突變中,目前大多數研究認為,PvuⅡ、HindⅢ多態性變化能夠降低脂蛋白脂酶的活性,引起脂質代謝紊亂,而對于 LPL基因 S447X多態性則多數研究認為該基因突變是一種保護性變異,能夠改善血脂譜。Nierman等[12]研究顯示,LPLS447X攜帶者血液中含豐富三酰甘油的脂蛋白 (TRL)轉化增快,LDL apoB100清除率增加,并且肝前血漿 LPL濃度增長了 4倍。關于該多態性對 TG和 HDL-C的影響,Lee等[13]通過對居住新加坡的華人、馬來人及亞洲印第安人的研究顯示,LPLS447X多態性在該研究人群中發生率很高,且 X447等位基因攜帶者血 TG水平較非基因突變者明顯降低,而血漿 HDL-C水平則明顯升高。同時該研究還發現,在女性 X447攜帶者中,血漿 LDL-C水平也明顯下降。Thu等[14]對 351位越南 7～9歲女孩研究發現,與S447S基因型相比較,S447X多態性與血漿高 HDL-C水平相關 (7.4%,P=0.007),并且會導致血 TG水平降低(-13.6%,P=0.04)。Wittrup等[15]對丹麥正常人及心肌缺血者的研究顯示,女性 S447X攜帶者雜合型和純合型血漿 TG水平分別下降 0.11 mmol/L和 0.18 mmol/L(P=0.001和 P=0.37);HDL-C水平分別升高 0.07 mmol/L和 0.03 mmol/L(P=0.001和 P=0.99)。男性雜合型和純合型攜帶者血漿 TG水平分別下降 0.20 mmol/L和 0.41 mmol/L(P＜0.001和 P=0.06);HDL-C水平分別升高 0.05 mmol/L和 0.17 mmol/L(P=0.02和 P=0.04)。但亦有對亞洲種族的研究認為 X447等位基因與 HDL-C水平之間關聯不明顯[16],甚至沒有關聯[17]。

本研究結果顯示,LPL S/X及 X/X基因型患者在膳食行為干預后 FPG、TG等指標水平明顯降低而血漿 HDL-C水平明顯升高,干預前后有明顯差別;S/S基因型患者在膳食行為干預后盡管血脂水平較干預前有所降低,但差別無顯著性。對不同基因型患者膳食干預后各項指標進行比較發現,S/X及X/X基因型患者干預后 FPG、TG及 HDL-C等指標變化幅度顯著大于 S/S基因型患者,表明 S/X及 X/X基因型的 T2DM患者對膳食干預更為敏感。進一步表明 LPLS447X基因型不僅影響正常人的血脂水平,而且影響 T2DM患者的血脂、血糖水平。提示臨床醫生在制定和實施膳食干預措施時,除考慮患者的年齡、性別、吸煙、飲酒等生活習慣外,還必須考慮患者自身的遺傳背景,有針對性地開展飲食干預,以減少干預治療的盲目性,提高 T2DM的治療效果,減少不必要的人力、物力和財力資源的浪費。

LPLS447X多態性有益于患者血脂、血糖水平。雖然有研究認為其機制可能通過改變 LPL結構產生缺陷的 LPL分子;也可能通過增加或降低 mRNA轉錄,最終影響蛋白質水平;或通過其他潛在機制影響 LPL酶活性及 LPL的其他功能,包括催化功能、分泌功能、亞基間的聚合狀態、與肝素及底物的結合能力等。對此,部分學者做出了如下推斷,Nierman等[12]認為,可能與截斷突變導致的 LPL二聚體脂解活性增高有關,或是由于 LPLS447X蛋白質在羧基末端缺少了兩個氨基酸致使LPL-TRL結合更加牢固,調節并易化了酶對血脂的轉化。也有研究認為 S447X突變可能增加了 LPL與脂蛋白及細胞表面受體的相互作用,或者增強了其酶活性以外的功能,如通過介導受體對脂蛋白攝取的橋梁作用增強從而加快了 TG的清除[18]。亦有研究認為突變通過增加或降低 mRNA轉錄,最終影響蛋白質水平。因此,S447X多態性究竟是通過哪一種途徑使 LPL生物學功能發生改變尚需進一步研究。

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