尿激酶聯(lián)合黃芪對(duì)環(huán)孢素 A大鼠慢性腎纖維化組織中核因子 -κB表達(dá)的影響及意義

羅正茂,何 鳳,王 寅,張建林,張 虹,羅 仁,童俊容

腎小管間質(zhì)纖維化是腎間質(zhì)區(qū)各種纖維細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)的最終結(jié)果,而纖維細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1]。多種炎性遞質(zhì)如:炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子等參與了腎間質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)的病理生理過程。核因子 -κB(NF-κB)是一種與炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)交聯(lián)和細(xì)胞凋亡等有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,參與了多種炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[2]。既往的體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),尿激酶(urokinase-type plasminogen activator,uPA)可減輕腎間質(zhì)的炎癥反應(yīng),改善間質(zhì)纖維蛋白的沉積[3],其是否通過影響NF-κB的活化負(fù)性調(diào)控腎間質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)來發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用。本研究利用環(huán)孢素 A(cyclosporin A,CsA)慢性腎病大鼠模型,探討 uPA聯(lián)合黃芪 (astragalus mongholicus,AM)對(duì) CsA腎病大鼠腎組織 NF-κB活性的影響及意義。

圖 1 各組大鼠腎組織的病理結(jié)構(gòu)變化 (HE染色 ×400)Figure 1 Pathological structural changes of the renal tissue in five groups

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 黃芪注射液 2 g/ml,購自成都地奧九泓制藥廠;尿激酶注射液5萬 U/支,購自廣東天普公司;環(huán)孢菌素 A,購自瑞士諾華公司;橄欖油,意大利原裝進(jìn)口;羥脯氨酸試劑盒,購自南京建成生物工程研究所;兔抗人 NF-κB p65多克隆抗體、小鼠抗人 p-p65單克隆抗體、小鼠抗人 IκBα單克隆抗體、兔抗小鼠 IκBβ多克隆抗體均購自美國 cell signal公司;小鼠抗人 β-actin單克隆抗體、小鼠抗人 α-tubulin單克隆抗體均購自美國 Santa cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性 SD大鼠,6～8周齡,體質(zhì)量 200～250 g,由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立和分組 SD大鼠飼養(yǎng)于光控及溫控動(dòng)物室,實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物先在動(dòng)物室飼養(yǎng) 1周,以適應(yīng)環(huán)境。大鼠給予低鹽飲食 (鈉含量 0.05%),隨機(jī)分為5組:(1)對(duì)照組 (n=5):口服灌胃橄欖油 (1 ml·kg-1·d-1);(2)模型組(n=5):口服灌胃 CsA(25 mg· kg-1·d-1);(3)uPA治療組 (n=7):口服灌胃 CsA(25 mg·kg-1·d-1),同時(shí)給予uPA皮下注射治療 (2 000 U·kg-1·d-1);(4)AM治療組 (n=7):口服灌胃 CsA(25 mg·kg-1·d-1),同時(shí)給予AM腹腔注射治療 (10 g·kg-1·d-1);(5)聯(lián)合組 (n=7):口服灌胃 CsA(25 mg·kg-1·d-1),同時(shí)給予 uPA皮下注射 (2 000 U·kg-1·d-1)、AM腹腔注射治療 (10 g·kg-1·d-1)。每組大鼠均給藥 4周,各組于 4周末取雙側(cè)腎組織,去除腎周脂肪組織和腎包膜,冠狀面切開組織,部分組織用 4%甲醛固定,其余組織于液氮保存。

1.3.2 腎組織病理學(xué)分析 腎組織標(biāo)本經(jīng) 4%甲醛固定,石蠟包埋,切成 4μm厚的切片,60℃烤片 1 h后,分別經(jīng)二甲苯脫蠟,分級(jí)乙醇脫蠟至水,按 HE染色步驟進(jìn)行染色。每張切片隨機(jī)選取觀察15個(gè)互不重疊的高倍視野,計(jì)算腎皮質(zhì)中發(fā)生損害 (腎小管擴(kuò)張、萎縮、管型、壞死或小管炎)的腎小管數(shù)目和總腎小管數(shù),以損害的腎小管數(shù)目占總腎小管數(shù)的百分比表示腎小管損害的程度。

1.3.3 羥脯氨酸測定 取液氮保存的腎組織 100 mg,嚴(yán)格按羥脯氨酸測試盒(南京建成公司)說明書操作。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品配成標(biāo)準(zhǔn)液,蒸餾水為空白對(duì)照,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本中羥脯氨酸含量。

1.3.4 間接免疫熒光染色 新鮮腎組織行 5μm厚冷凍切片,室溫干燥,4℃丙酮固定 10 min。磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗滌,5 min×3次,胎牛血清 (BSA)封閉30 min,小鼠抗人 p-p65單克隆抗體 (1∶100)4℃過夜,PBS洗滌 5 min×3次,滴加山羊抗鼠 IgG-TRITC,室溫孵育 60 min,PBS洗滌 5 min×3次,DAPI染核5min,PBS洗滌 5 min×3次,90%緩沖甘油封片,熒光顯微鏡觀察,腎組織細(xì)胞內(nèi)有紅色顆粒為陽性。每次染色均同時(shí)以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照。每張切片 200倍下隨機(jī)選取 15個(gè)不重疊視野,拍片,計(jì)算陽性表達(dá)部位染色面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積比值,并取平均值。1.3.5 Western 印跡法檢測 p-p65、p65、IκBα和 IκBβ蛋白的表達(dá) 取液氮保存的腎組織 100 mg,加適量組織蛋白裂解液后,用電動(dòng)勻漿器勻漿,冰中靜置30 min,離心,取上清,用 Micro BCA Protein Kit(美國 Piercr公司)測定蛋白質(zhì)濃度。加蛋白上樣緩沖液,煮沸 5 min,瞬時(shí)高速離心,分別取不同組織的總蛋白50μg經(jīng) 10%SDS-PAGE凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙酰 (PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉 1 h,加入一抗p-p65、p65、IκBα、 IκBβ、β-actin和α-tubulin,均 1∶1 000稀釋,4℃過夜。洗膜后,再加辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗,室溫孵育 1 h,洗膜后進(jìn)行顯色,曝光于 X線膠片上,圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描,用 Image J分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值數(shù)字化。以 β-actin或 α-tubulin為內(nèi)參,用目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以 (x±s)表示,多個(gè)樣本均數(shù)比較用 One-way ANOVA,多組間的兩兩比較采用 LSD檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)由 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理改變 與對(duì)照組相比,模型組出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤及細(xì)胞增殖,腎小管變性、萎縮,部分腎小管消失,集合管、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張呈囊狀,皮質(zhì)部變薄,腎小管損傷程度明顯較對(duì)照組重 (P＜0.05)。與模型組相比,uPA組和 AM組腎小管損傷程度明顯減輕 (P＜0.05),且聯(lián)合組治療效果更佳,除對(duì)照組外,其腎小管損傷程度最輕 (見圖 1、表 1)。

2.2 羥脯氨酸含量 羥脯氨酸是膠原蛋白中必含氨基酸,膠原成分中羥脯氨酸的含量約占 14.4%,所以腎間質(zhì)膠原可通過測定腎組織羥脯氨酸的含量來定量評(píng)價(jià)。對(duì)照組羥脯氨酸的含量呈基礎(chǔ)表達(dá)量,模型組羥脯氨酸的含量較對(duì)照組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與模型組比較,uPA組和 AM組腎組織羥脯氨酸的含量減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),uPA組與 AM組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)。聯(lián)合組羥脯氨酸的含量僅高于對(duì)照組,均較其他 3組減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P均 ＜0.05,見表1)。

圖 2 免疫熒光和Western blot共同檢測NF-κB的激活變化 (免疫熒光×200)Figur e 2 The activation of NF-κBdetected by immunofluorescence and western blot

表 1 各組大鼠腎小管損傷程度及腎組織羥脯氨酸的含量比較Table 1 The degree of renal tubular injury and the content of hydroxyproline in renal tissue in five groups

2.3 NF-κB p65核轉(zhuǎn)位 p65是 NF-κB的一個(gè)重要的亞單位,NF-κB活化后,p65發(fā)生磷酸化 (p-p65),且由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核。因此,我們應(yīng)用免疫熒光觀察 p-p65的表達(dá)及定位,且通過Western印跡法檢測 p-p65及 p65的表達(dá)水平。免疫熒光檢測結(jié)果:對(duì)照組 pp65的熒光強(qiáng)度極弱,而模型組 p-p65的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),且 p-p65定位于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞的胞核內(nèi)。與模型組比較,uPA組、AM組及聯(lián)合組 p-p65的熒光強(qiáng)度均減弱 (見圖 2:A～E)。Western印跡結(jié)果:主帶 p65表達(dá)各組間無差異。對(duì)照組 p-p65有基礎(chǔ)量表達(dá),而模型組 pp65表達(dá)增強(qiáng) 〔(0.52±0.04)%vs(0.11±0.01)%,P＜0.05〕。各治療組 p-p65表達(dá)均較模型組減低 (P＜0.05),并且聯(lián)合組 p-p65表達(dá)較 uPA組和 AM組低 (P＜0.05,見圖 2:F、G)。

2.4 腎組織中 IκBα和 IκBβ的降解 為進(jìn)一步證實(shí) NF-κBp65核轉(zhuǎn)位是由于 NF-κB的抑制因子 IκB發(fā)生磷酸化及降解,本研究應(yīng)用 Western印跡法檢測細(xì)胞內(nèi)IκBα和 IκBβ的水平。對(duì)照組 IκBα呈高表達(dá),而模型組 IκBα表達(dá)減低 〔 (0.09±0.01)%vs(0.63±0.05)%,P＜0.05〕。各治療組 IκBα表達(dá)均較模型組高,且聯(lián)合組高于 uPA組和 AM組 (P＜0.05)。IκBβ的表達(dá)各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見圖 3)。

3 討論

腎小管間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病發(fā)展到終末期腎衰竭的共同途徑,其病理過程主要包括炎癥通路的激活、腎小管上皮細(xì)胞 -間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 (EMT)、細(xì)胞外基質(zhì) (ECM)合成與降解異常等[4]。本研究病理結(jié)果顯示,CsA大鼠腎組織出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞萎縮、消失,腎間質(zhì)區(qū)增寬伴炎癥細(xì)胞浸潤,提示 CsA大鼠腎臟發(fā)生了炎癥反應(yīng)的病理改變。模型組羥脯氨酸的含量明顯高于對(duì)照組,表明 CsA大鼠腎組織纖維化加重。Satoshi等[5]研究證實(shí),CsA可引起大鼠腎組織的炎癥反應(yīng)和纖維化的病理改變,并且腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)先于間質(zhì)纖維化形成。本研究結(jié)果與此相一致。在此基礎(chǔ)上,我們發(fā)現(xiàn)AM及 uPA治療對(duì) CsA大鼠腎臟病理改變及纖維化程度均有不同程度的改善,且二者聯(lián)合治療的效果更佳。

圖 3 各組大鼠腎組織中 IκBα和 IκBβ的降解Figure 3 The degradation of IκBαand IκBβin renal tissue in five groups

NF-κB在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。NF-κB被激活后發(fā)生磷酸化而移位入核,并與 DNA結(jié)合啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄,而 IκB與之解離并被降解[6]。我們檢測 p-p65及總的 p65水平,以評(píng)價(jià)各組 NF-κB的激活程度。本研究中,免疫熒光檢測結(jié)果表明,各組大鼠腎組織有 pp65表達(dá),且定位于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球臟層上皮細(xì)胞及系膜細(xì)胞的胞核內(nèi),提示 NF-κB被激活。同時(shí) Western印跡蛋白定量的結(jié)果顯示,各組總的 p65水平無明顯差異,而 p-p65在模型組表達(dá)最高,治療組的 p-p65蛋白水平介于模型組與對(duì)照組之間,且較模型組有顯著的差異,說明 AM及 uPA能抑制 NF-κB的激活,聯(lián)合組 p-p65蛋白水平均低于其他各組,進(jìn)一步提示及 uPA聯(lián)合治療對(duì) NF-κB激活的抑制作用更強(qiáng)。

IκB是細(xì)胞內(nèi) NF-κB的主要抑制因子,NF-κB激活的同時(shí)伴有 IκB的降解。因此,本研究還檢測了 IκB的兩個(gè)亞基 IκBα和 IκBβ的蛋白水平,結(jié)果顯示,對(duì)照組 IκBα蛋白表達(dá)最高,而模型組IκBα蛋白明顯減少,而其 p-p65的表達(dá)顯著高于對(duì)照組,表明 NF-κB p65發(fā)生磷酸化并核轉(zhuǎn)位是由于 NF-κB的抑制因子 IκBα降解所致。AM及 uPA治療的各組 IκBα均明顯高于模型組,且聯(lián)合組IκBα明顯高于 uPA組及 AM組,這充分證實(shí)聯(lián)合治療能更好地抑制 NF-κB激活。IκBβ的降解各組間無明顯差異,說明 uPA及 AM對(duì) IκBβ的降解無明顯作用,也進(jìn)一步表明它們是通過調(diào)控 IκBα的降解發(fā)揮作用。

腎臟 NF-κB通路激活直接參與纖維化的發(fā)生、發(fā)展[7],NF-κB通路激活,可釋放炎性遞質(zhì) 〔(IL-1、腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)等〕,它們浸潤腎間質(zhì)區(qū)的成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生炎性反應(yīng),進(jìn)一步產(chǎn)生并釋放一系列致腎毒性細(xì)胞因子和生長因子 (PDGF、TGF-β等),這些因子可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化,形成肌成纖維細(xì)胞,開始大量分泌、合成一系列膠原纖維蛋白,即 ECM。本研究中,聯(lián)合組 NF-κB激活較低,且該組的羥脯氨酸含量也較低,即纖維化程度較輕,這可能是黃芪及尿激酶對(duì) NF-κB抑制的結(jié)果。新近研究表明,NF-κB通路激活可上調(diào)表達(dá) Snail蛋白[8],而 Snail是重要的觸發(fā) EMT的信號(hào)分子[9],可加重腎臟纖維化。

研究發(fā)現(xiàn),AM通過促進(jìn) HGF生成,下調(diào) TGF-β1表達(dá),抑制肌成纖維細(xì)胞的激活,從而發(fā)揮抗腎纖維化的作用[10]。本研究證實(shí),單用 AM也可抑制 NF-κB,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)了其抗纖維化的作用機(jī)制。uPA可將無活性的纖溶酶原激活為纖溶酶,發(fā)揮降解 ECM的作用[11]。由此可見,uPA不僅可直接降解 ECM,還可能通過抑制 NF-κB的活性從而減少 ECM的生成。本研究通過建立 CsA慢性腎病模型,發(fā)現(xiàn) NF-κB通路能介導(dǎo)腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展,而 AM聯(lián)合 uPA治療能通過抑制 NF-κB的激活,從而發(fā)揮抑制腎臟纖維化的作用,為慢性腎纖維化的防治提供新的途徑。

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