15N標記L-胱氨酸

羅 勇,湯財德,李美華,宋家龍,陸平曄,杜曉寧

(上海化工研究院上海穩定同位素工程技術研究中心,上海 200062)

15N是氮元素的穩定同位素之一,可以用作示蹤元素,廣泛應用于生物化學、醫學、藥物學、農業科學等領域。15N標記氨基酸和多肽是研究醫學和生命科學的重要工具,在蛋白質的人工合成、判定生物活性物質(多肽、蛋白質)的化學結構及藥用機理等方面起著獨特的示蹤作用,其應用越來越廣泛,市場前景良好[1]。L-胱氨酸和L-半胱氨酸均為含硫氨基酸,屬人體非必需氨基酸,在體內均可由蛋氨酸轉變而來。其中,從L-半胱氨酸出發可生成谷胱甘肽(G-SH),由于其活性基團巰基的存在,使之具有許多重要的生理功能,如整合解毒作用、增強肝功能、抗氧化作用和促進毛發生長等。L-胱氨酸同時也是多種硬蛋白質如角質蛋白的重要成分。

L-胱氨酸廣泛存在于動物的毛、發、骨、角中,目前工業上主要采用生物化學方法,經由蛋白質(如毛發)水解、分離、精制而成。L-胱氨酸的化學生產具有較大的難度,合成過程中需對巰基進行保護和解保護[1-2]。此外,經化學方法合成的通常為消旋的D,L-氨基酸,不具有光學活性,必須經化學或酶法拆分以得到有光學活性的L型產物。

15N標記的L-胱氨酸是研究蛋白質代謝的重要示蹤劑之一,目前國際上僅ISOTOPE等少數公司能提供產品,價格昂貴,售價高達每克4 640美元。因此開發15N標記L-胱氨酸的制備工藝具有較好的學術意義和經濟效益。

基于L-胱氨酸可在酸性溶液中還原為L-半胱氨酸,L-半胱氨酸也可在堿性環境中氧化為L-胱氨酸,本實驗擬設計一個新的合成路線合成15N-L-胱氨酸。元素分析儀:美國PE公司;LC-20AT高效液相色譜:日本島津公司;Thermo Finingan TSQ/A ccela質譜儀:美國熱電公司;MAT-271氣體同位素質譜計:西德菲尼根瑪特公司。

15NH4Cl:上海化工研究院生產;鄰苯二甲酸、丙二酸二甲酯、芐硫醇、三聚甲醛等皆為市售化學純或分析純試劑。

2 實驗方法

總體合成路線設計為三步:第一步先合成S-芐基-D,L-半胱氨酸;第二步,采用酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸,包括對 S-芐基-D,L-半胱氨酸乙酰化、酶拆分和消旋化;第三步,對拆分后的S-芐基-D,L-半胱氨酸解保護,脫除芐基后再經氧化得到L-胱氨酸。

2.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成

1 主要儀器與試劑

WRS-1數字熔點儀:上海精密儀器有限公司;Bruker biospin AC-P200型核磁共振儀:德國Bruker公司;Nicolet FT-IR 6770紅外吸收光譜儀:美國Nicolet公司;Perkin-Elmer 240C

S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成采用經過改進的Gabriel方法,其合成路線示于圖1。鄰苯二甲酸鉀鹽(1)與溴代丙二酸二甲酯縮合得到鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2),其鈉鹽(3)再與芐基氯甲硫醚(4)反應得到N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5),再經水解得到S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)。

圖1 S-芐基-D,L-半胱氨酸的合成路線

2.1.1 鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的制備

鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)的合成參考文獻[3-4]。將NaOH溶液緩慢滴加到26.75 g(0.50mol)NH 4 Cl中,生成的 NH 3隨 N2氣流通入由83.1 g(0.50 mo l)鄰苯二甲酸和200m L水配成的懸濁液中。待NH 3完全被鄰苯二甲酸溶液吸收后,先于100℃下蒸除溶液中的水,然后緩慢升溫至200℃脫水,最后將溫度逐漸上升至300℃,冷卻得白色固體74.1 g。將上述制得的鄰苯二甲酰亞胺粗品溶于無水乙醇,于攪拌下緩慢滴加KOH的無水甲醇溶液,室溫下保持3 h,過濾,用無水乙醇洗滌3次,得鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)白色晶體88.9 g,收率96.1%。

2.1.2 鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)及其鈉鹽(3)的制備

將18.52 g(0.1 mol)N-鄰苯二甲酰亞胺鉀鹽(1)與23.90 g(0.1m ol)新鮮制備的溴代丙二酸二乙酯均勻混合,在110℃油浴中加熱1 h,冷卻后加水攪拌,反應物變為固體。將其轉移到研缽內反復研磨,水洗抽濾后得到29.80 g(2),收率97.6%。將制得的產物(2)加熱溶解于100 m L甲苯中,加入2.75 g(0.12 mol)金屬鈉條,回流攪拌 3 h,沉淀經甲苯洗滌,干燥,得30.7 g黃色產物(3),收率96.2%。

2.1.3 芐基氯甲硫醚(4)的制備

將49.7 g(0.40 mol)芐硫醇與40.5 g(0.45m ol)三聚甲醛在冰浴中冷卻,并用干燥過的HCl氣飽和,然后加入 70 g(0.63 m ol)CaCl2,再于室溫下保持24 h。過濾除去固體物質后,母液用5 mol/L NaOH溶液洗滌3次,無水Na2 SO4干燥,過濾后,減壓(0.27 kPa)蒸餾,收集 102℃的餾分,得到芐基氯甲硫醚(4)21.1 g,收率30.5%。

2.1.4 N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)的制備

將5.00 g(0.015 3mol)鈉鹽(3)和2.70 g(0.015 6 mo l)芐基氯甲硫醚(4)和50 m L無水甲苯攪拌回流12 h,過濾。沉淀經甲苯洗滌后,再用無水乙醇重結晶,得到產物(5)4.0 g,產率59.4%。產物(5)的熔點為79.5～80.4℃;1H NMR(CDCl3):1.28(t,6H,J=7.0 H z,—CH 3),3.55(s,2H, —C—CH 2—S—),3.70(s,2H,—S—CH2—A r),4.32(q,4H,J=7.0Hz,—OCH2—),7.10 ～ 7.27(m,5H,—C6H5),7.72～7.81(m,4H,—C6H4)。

2.1.5 S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)的制備

將4.0 g縮合產物(5)懸浮于25m L V(乙醇)∶V(水)=1∶1混合液中,于攪拌下逐滴加入20m L 5 mol/L NaOH,保持溫度55～60℃,攪拌1 h后,加入足量濃鹽酸酸化,加熱水解2 h后蒸干溶液,滴加少許NaOH溶液至溶液呈中性(剛果紅)。將得到的沉淀過濾,并懸浮于沸騰的95%乙醇中,趁熱過濾,冷卻后得到晶體狀S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)0.98 g,收率50.1%。產物(6)的熔點:211～214℃;元素分析實測值(計算值,%):C 56.80(56.87),N 6.58(6.63),H 6.15(6.20);MS-EI(m/z,%):211.1(M+,10),91.1(100);IR(υ/cm-1,KBr):3 062(C —H,A r—H),2 934(O—H,—COOH),1 500,1 588(C —C,benzene),1 400(C=O,—COOH)。

2.2 氨基酰化酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸

氨基酰化酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸的化學過程示于圖2。

圖2 氨基酰化酶法拆分S-芐基-D,L-半胱氨酸的化學過程

2.2.1 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的(7)的制備

將6.0 g(0.028 4 mol)D,L-硫芐基半胱氨酸(6)溶于48m L 1 mol/LNaOH溶液中,于冰浴下逐滴滴加12 m L乙酸酐,保持2 h后,再用濃鹽酸酸化至pH 為2,經抽濾、水洗、干燥,得到6.90 g白色固體(7),收率95.9%。熔點:158.7℃。

2.2.2 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的拆分

[5-8]對產物(7)進行拆分:將6.90 g(0.027 2m ol)上述制得的 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸溶于50 m L 1 mol/L NaOH溶液中,調節溶液的pH 約為8.0,將溫度控制在37℃,加入0.20 g氨基酰化酶,于輕微攪拌下保持30 h,再調節溶液的pH至5.5,4℃過夜,抽濾,洗滌后得到白色固體S-芐基-L-半胱氨酸(8),收率 82.6%。熔點:213.6℃,比旋光[α]D=+19.4°(NaOH 濃度為1mol/L,20 ℃)。

2.2.3 N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸(8)的消旋

參考文獻[9]進行消旋化:稱取3.0 g產物(8)溶于20 m L 2.5 m ol/L NaOH中,升溫至60～65℃,保溫1 h。逐滴加入20 m L乙酸酐,恒溫30m in,冷卻。用濃鹽酸將溶液酸化至pH=2,保持4℃過夜,沉淀物過濾烘干后用于二次拆分,可繼續得到白色固體(8)。經二次拆分后,S-芐基-L-半胱氨酸(9)的拆分總收率為62%。

2.3 15N-L-胱氨酸(11)的制備

對N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸(9)進行解保護/氧化,制備L-胱氨酸,其化學過程示于圖3。

圖3 對N-乙酰-S-芐基-L-半胱氨酸解保護/氧化得到L-胱氨酸的化學過程

在-50 ℃下,將 3.5 g(0.016 5 m ol)產物(9)加入到50m L液氨中,再緩慢加入小塊金屬鈉,維持藍色3～5 min不褪,空氣中蒸發除去液氨,加入50 m L水;調pH 至8,加入痕量FeCl3,通入空氣流氧化;經亞硝酸鐵氰化鈉檢測確定無硫醚后,過濾干燥。得白色固體(11)1.29 g,收率:78.0%。熔點:258℃。

2.4 15N-L-胱氨酸的豐度實驗

在上述實驗基礎上,以15NH 4 Cl(10.20%15N)為原料,進行L-胱氨酸合成的豐度驗證實驗,具體合成方法如前所述。

3 結果與討論

由于穩定同位素15N原料非常昂貴,衡量合成路線優劣的主要因素是穩定同位素原子的利用率、產物的生物活性和同位素豐度。其中,經Gabriel法改良的丙二酸酯法是15N標記氨基酸的重要合成方法。L-胱氨酸的巰基非常活潑,在合成過程中需對此加以保護。可供選擇的保護基有芐基、二苯甲基、三苯甲基等,其中芐基最為常用。因此,本工作采用芐基作為巰基保護基,將商業上較易獲得的芐硫醇引入,制得芐基氯甲硫醚,并作為合成前體。此外,經化學合成方法得到的通常為消旋物,不具有光學活性,因此必須經化學或酶法拆分得到L型產物,最后,再經解保護過程脫除保護基,得到目標產物15N標記L-胱氨酸。

3.1 S-芐基-D,L-半胱氨酸合成中的影響因素

在15N-L-胱氨酸的合成過程中存在多個關鍵合成步驟,對最終產物的收率影響很大。

3.1.1 反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

在產物(2)的合成過程中,保持其他條件不變,僅改變油浴溫度,觀察溫度對產物(2)收率的影響,結果列于表1。由表1可知,在實驗條件下,反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,在110～120℃溫度范圍內可獲得良好的收率。隨著溫度進一步升高(高于130℃),產物的熔程變寬,表明副產物增多,收率降低。

3.1.2 反應時間對N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

產物(5)的合成過程中,保持其他條件不變,僅改變反應時間,觀察反應時間對產物(5)收率的影響,結果列于表2。由表2可知,在實驗條件下,反應時間對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的收率有較大影響,隨著反應時間延長,產物收率顯著增加;12 h以后,進一步延長反應時間(16 h),反應收率不再有明顯變化,因此,該步反應時間以12 h為宜。

表1 反應溫度對鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(2)收率的影響

表2 反應時間對N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯(5)收率的影響

3.1.3 水解時間對S-芐基-D,L-半胱氨酸(6)收率的影響

在探索實驗中發現,N-芐基氯甲硫醚基鄰苯二甲酰亞胺抱丙二酸二乙酯的水解時間是影響S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的重要因素。反應按2.1.5進行,在其他條件不變的情況下,只改變鹽酸水解的時間,考察水解時間對D,L-硫芐基半胱氨酸收率的影響,結果列于表3。由表3可知,隨著反應時間延長,產品收率上升,2 h時收率最高,達50%,此后隨著水解時間進一步延長,產品收率略有下降。因此,實際水解時間應控制在2 h。

表3 水解時間對 S-芐基-D,L-半胱氨酸收率的影響

3.2 氨基酰化酶法拆分D,L-硫芐基半胱氨酸中的影響因素

將所制得的S-芐基-D,L-半胱氨酸進行乙酰化,并采用氨基酰化酶對其進行光學拆分,再將具有光學活性的S-芐基-L-半胱氨酸從拆分混合液中分離出來。為了提高拆分的收率,還需對未參與反應的N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸進行消旋化,進行再次拆分。

在本研究過程中,先后通過單因素考察和正交實驗,對影響氨基酰化酶法拆分N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸生成S-芐基-L-半胱氨酸的多種影響因素進行了優化,找到了比較合適的工藝條件[11]:反應物 N-乙酰-S-芐基-D,L-半胱氨酸的量為5 g,pH為8.0,反應溫度為37℃,酶用量為200 m g,反應液總體積為50 m L,反應時間為30 h。在此條件下,S-芐基-L-半胱氨酸拆分的單程收率達到45%,N-乙酰-S-芐基-D-半胱氨酸回收率達到88%。經過兩次拆分以后,S-芐基-D,L-半胱氨酸總的拆分收率達到62%。

3.3 保護基的脫除

解保護即脫除S-芐基-L-半胱氨酸上的保護基芐基。可供選擇的體系有HF體系[10]和Na/NH3體系。HF體系收率較高(90%),但HF氣體毒性大,對于實驗裝置要求很高;Na/NH3體系收率相對較低(78%),操作相對容易,危險性較小。因此在實驗中選擇Na/NH3體系進行解保護。由于L-半胱氨酸在中性和堿性溶液中易被氧化生成 L-胱氨酸,且 L-胱氨酸難溶于水,因此在解保護后,在痕量Fe3+的催化下,于近中性溶液中將L-半胱氨酸氧化為L-胱氨酸。

3.4 產品的分析與表征

對于終產品進行紅外分析,結果示于圖4。根據圖 4可計算 IR(υ/cm-1,KBr)得:2 980(O —H,—COOH),1 680(C=O,—COOH),1 590(N—H,—NH2),1 480(C—H,—NH2—),1 400(C—O,—COOH),1 110(C—N,—CH—NH2)。薄層層析鑒定表明,產物與L-胱氨酸標樣具有相同的R f。比旋光度[α]D為-215°(c=1,1 m ol/L HCl,20 ℃),與標樣在該條件下的比旋光度-220°很接近。在HPLC上檢測產物純度大于98%。元素分析,C6H12N2S2O4實測值(計算值):C 29.82%(29.99%),N 11.59%(11.66%),H 6.15%(6.13%)。

圖4 L-胱氨酸的紅外光譜

3.5 15N-L-胱氨酸豐度實驗驗證

通過優化合成方法,以NH 4Cl和芐基氯甲硫醚為前體進行了L-胱氨酸的合成,總收率為13.9%,產物的化學純度和光學純度符合要求。在此基礎上,以15NH4Cl(10.20%15N)為標記前體,進行L-胱氨酸合成的豐度實驗,合成總收率13.5%,15N的豐度為10.18%,未出現同位素稀釋現象。

4 小 結

設計并完成了適合15N標記的L-胱氨酸,以15NH4 Cl為起始原料,通過改進的Gabriel方法得到S-芐基-D,L-半胱氨酸,再經氨基酰化酶法拆分和解除保護后得到15N標記L-胱氨酸。紅外、HPLC質譜、元素分析等分析手段均確證了多種中間體和15N標記L-胱氨酸的結構;以同位素原料計總產率為13.5%,所用工藝不會產生同位素稀釋,可以滿足商品化15N標記L-胱氨酸及相關衍生物的合成。

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