一株蟲草類真菌的液體發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖培養(yǎng)基的優(yōu)化*

福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 柯 軼 巫文政 毛 寧

冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)是球殼目(Sphaeriales)、麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)的蟲生真菌[1]。自古以來冬蟲夏草就為廣大人們所熟知的具有保健作用的食用菌。冬蟲夏草主要含有核苷類化合物、氨基酸、多糖類、甘露醇等成分，多糖是冬蟲夏草所含的有效生理活性物質(zhì)中最重要最豐富的種群之一，具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗輻射、降血糖、降血脂等生物學(xué)活性[2]。多糖是當(dāng)今新藥開發(fā)的重要方向之一，是冬蟲夏草開發(fā)研究的一個重要突破口。

天然蟲草自然寄生率低，生長條件苛刻，加上人們的濫采，導(dǎo)致天然資源緊缺。天然蟲草已遠遠不能滿足日益增長的市場需求，而且天然蟲草目前市場價格昂貴，已高達每公斤3～4萬元。研究表明采用人工液體發(fā)酵的蟲草菌絲的有效成分含量與天然蟲草幾乎相當(dāng)[3]，并且液體發(fā)酵法能在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量的菌絲體，因此人工發(fā)酵蟲草將是生產(chǎn)蟲草產(chǎn)品的重要手段，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

蟲草真菌Fc-001 （Cordyceps fungi Fc-001），福建師范大學(xué)菌保藏中心保藏

1.1.2 試劑

玉米粉，玉米淀粉，早米粉，白糖，葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，奶粉，黃豆粉，花生粉，酵母膏，玉米漿，牛肉膏，均為市售。

MgSO4·7H2O，KH2PO4，三氯甲烷，正丁醇，乙醇，苯酚，硫酸，均為分析純。

1.1.3 主要儀器

DELTA 320PH計，SHK-99-Ⅱ型臺式恒溫搖床，SONICS超聲波破碎儀，HH-4型恒溫水浴鍋，日立CR21G高速離心機，721分光光度計。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA

種子培養(yǎng)基（%）: 葡萄糖2，酵母粉1，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，滅菌30min。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（%）:玉米淀粉4，酵母粉2，酵母膏0.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，115℃，滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子液培養(yǎng):將活化的斜面菌種接種于種子培養(yǎng)基中，24℃、180r/min振蕩培養(yǎng)3d。

發(fā)酵培養(yǎng):將培養(yǎng)好的液體種子按5%(V／V)的移種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d。每個因素做兩個重復(fù)。

1.2.2 多糖提取

發(fā)酵產(chǎn)物通過過濾分離菌絲體并用蒸餾水洗3遍，將菌絲體干燥至恒重。干菌絲研磨，過200目篩后稱取0.4g菌絲體粉末溶于50mL蒸餾水中，置超聲波破碎8min，90℃水浴2h后定容至50mL，并離心得到上清液，用sevag法除蛋白[4]，將pH調(diào)至7.0，吸取10mL置于4℃醇析12h[5]，離心得到多糖沉淀并用40mL蒸餾水復(fù)溶。

1.2.3 多糖測定

1.2.3.1 測定方法

采用苯酚-硫酸法測定[6-7]。

1.2.3.2 測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制50 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL用蒸餾水補充至2.0mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，混勻，立即滴加濃硫酸5mL，搖勻，60℃水浴15 min，然后置冷水中冷卻15min，在490nm波長處比色。

1.2.3.3 樣品多糖測定

取樣品溶液0.2 mL用蒸餾水補充至2.0mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，混勻，立即滴加濃硫酸5mL，搖勻，60℃水浴15min，然后置冷水中冷卻15min，在490nm波長處比色。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立

用紫外分光光度計，在490nm的波長處比色，以試劑空白做參比，實驗結(jié)果見圖 1。

所得其線性回歸方程式y(tǒng) = 0.0068x + 0.0002，相關(guān)系數(shù)R=0.9998。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同碳源對多糖產(chǎn)量的影響

以4%的玉米粉、玉米淀粉、早米粉、白糖、葡萄糖為碳源的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（去除玉米淀粉）培養(yǎng)蟲草菌絲體，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響。結(jié)果見表1。由表1可以看出，以上述成分作為碳源的時候，對生物量的影響排序依次是:玉米粉＞早米粉＞玉米淀粉＞白糖＞葡萄糖，對蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響排序依次是:玉米淀粉＞玉米粉＞早米粉＞白糖＞葡萄糖。綜合考慮生物量，胞內(nèi)多糖含量等因素，最終決定以玉米淀粉作為碳源。

表1 不同碳源對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.3 不同氮源對多糖產(chǎn)量的影響

以 2%的酵母粉、蛋白胨、奶粉、黃豆粉、花生粉為氮源的發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（去除酵母粉）培養(yǎng)蟲草菌絲體，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對冬蟲夏草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的影響。結(jié)果見表2。由表2可以看出，以上述成分作為氮源時，花生粉作為氮源所獲得蟲草菌絲產(chǎn)量最高，酵母粉次之；酵母粉作為氮源發(fā)酵的菌絲中胞內(nèi)多糖含量明顯高于其他氮源。胞內(nèi)多糖總量依次為:酵母粉＞黃豆粉＞奶粉＞花生粉＞蛋白胨。綜合生物量及蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量因素，選擇酵母粉為最佳氮源。

表2 不同氮源對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.4 不同生物素對多糖產(chǎn)量的影響

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（去除酵母膏）分別由0.5%的酵母膏、玉米漿、牛肉膏作為生物素提供生長因子，不加生物素為空白對照，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d，研究其對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖的影響。結(jié)果見表3。由表3可以看出，酵母膏、玉米漿、牛肉膏都對蟲草菌絲體生長有促進作用，但以玉米漿、牛肉膏為生長因子時，蟲草菌絲胞內(nèi)多糖總量都少于空白對照，只有酵母膏對蟲草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量有促進作用。故選用酵母膏為最適生物素。

表3 不同生物素對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.5 不同pH對多糖產(chǎn)量的影響

將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH值調(diào)節(jié)至5、6、7、8，24℃，180r/min振蕩培養(yǎng)7d。結(jié)果見表4。由表4可以看出，起始pH 5.0的條件下獲得蟲草菌絲產(chǎn)量最高，但其胞內(nèi)多糖含量較低。蟲草菌絲體的量隨起始pH的增大而降低，單位質(zhì)量的菌絲中胞內(nèi)多糖含量隨起始pH的增大而增大。綜合生物量及蟲草胞內(nèi)多糖含量考慮，起始pH 7.0條件下能獲得較多的菌絲和最多的胞內(nèi)多糖。

表4 不同的起始pH值對冬蟲夏草胞內(nèi)多糖產(chǎn)量的影響

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以玉米淀粉，酵母粉，酵母膏，pH 進行四因子三水平正交優(yōu)化。正交試驗因素水平及結(jié)果見表5和表6，方差分析見表7[8-9]。

表5 正交試驗因素和水平表

表6 正交試驗結(jié)果直觀分析表

表7 方差分析表

正交試驗結(jié)果表明，影響蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖的因素依次為玉米淀粉，酵母粉，pH，酵母膏。方差分析結(jié)果表明，玉米淀粉和酵母粉對蟲草產(chǎn)多糖有極顯著作用，而酵母膏水平的改變和pH的改變無顯著作用，對多糖的產(chǎn)量影響不顯著。因此培養(yǎng)基中只需添加酵母膏0.1%，pH可以選擇在6.5～7.5之間。最終確定蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖最適培養(yǎng)基為:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

3 結(jié)論與討論

蟲草多糖是蟲草的主要活性物質(zhì)之一，它具有能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用，抗氧化，抗衰老，抗腫瘤，抗炎等多種活性作用，是當(dāng)今醫(yī)藥研究新的重點方向之一。但蟲草具有生長周期長，栽培困難等問題，因此，通過對其無性菌絲體進行液體發(fā)酵從而獲得活性產(chǎn)物，可以比較容易地獲得所需活性物質(zhì)，且縮短其生長周期，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在液體發(fā)酵培養(yǎng)中，根據(jù)所需的產(chǎn)物的不同，如:菌體，胞內(nèi)多糖，胞外多糖等等，培養(yǎng)基的配方也不大相同。本實驗先對蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖液體培養(yǎng)基條件進行單因素的篩選，試驗結(jié)果表明，玉米淀粉為最佳碳源，酵母粉為最佳氮源，酵母膏為最佳生物素，最適的pH為7.0，然后對其進行正交試驗，進一步確定蟲草產(chǎn)胞內(nèi)多糖最適配培養(yǎng)基為:玉米淀粉5%，酵母粉2%，酵母膏0.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.0。

同時，實驗結(jié)果也表明，最適合蟲草菌絲體生長的碳源是玉米粉，氮源是花生粉，生物素源是酵母膏，pH為5.0。因此，尋求一種既能提高蟲草菌絲體，同時又能增高蟲草胞內(nèi)多糖含量的培養(yǎng)基配方，成為進一步研究的方向。

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