黑木耳單核菌株交配型確認的研究

馬慶芳，張介馳，張丕奇，劉佳寧，孔祥輝，韓增華，戴肖東

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱150010）

黑木耳屬異宗結合單因子控制的二極性的菌類［1］。菌種選育是改造菌種，提高生物學效率的一項重要措施，單核體雜交育種是食用菌優良菌株選育較為常用而有效的育種方法。如何快速準確地確認單核菌株的交配型對育種研究有著十分重要的意義。而且真菌自然群體中交配型因子的研究可以加深相關遺傳背景的了解，為菌種鑒定提供一個良好的參考標準。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

黑木耳(Auricularia auricular)“黑29”，由黑龍江省科學院應用微生物研究所提供。采用原生質體再生法獲黑木耳“黑29”單核菌株100多株，經過表觀形態觀察、對峙試驗選出18株單核菌株，分別命名為 ：29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-7、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-14、29-15、29-16、29-17、29-18，用于其他試驗確認單核菌株交配型。

1.1.2 試劑

0.1mol/L pH 6.4的磷酸鹽緩沖液，TBE緩沖液0.09mol/L，Tris-硼酸，0.002mol/L EDTA。

1.1.3 培養基

cPDA母種培養基，OGF液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 菌絲表觀形態觀察

將“黑29”原生質體再生菌株轉接于cPDA母種培養基進行插片培養，待菌絲長至載玻片上后進行熒光檢測［2-3］。將熒光檢測確認為單核的“黑29”菌株重新轉接于cPDA平板上，觀察菌絲生長情況［4］。

1.2.2 酯酶同工酶技術檢測“黑29”單核菌株交配型

用OGF培養基，供試菌株靜止培養15d，過濾收集菌絲2～3g，-20℃下冷凍16h。冰浴研磨成糊狀，低溫12000rpm離心30min，冷凍備用。用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度2.5%。電極緩沖液Tris-Glycine系統，pH8.3。溴酚蘭作指示劑，4℃電泳。濃縮膠電壓為120V，分離膠電壓為220V，電泳4.0h左右，指示劑距前沿線1.0cm時取下凝膠，用醋酸-α-萘酯和堅牢蘭染色［5］。

1.2.3 黑木耳單核菌株回交試驗檢測其交配型

將已選出的單核菌株29-7與29-7、29-1、29-4、29-11、29-16兩兩配對，分別接入cPDA平板培養基中，菌株間距1.0cm，25℃恒溫培養，7～10d后觀察不同菌株菌絲交匯后的生長情況。取兩菌株中間交匯處的菌絲進行純培養，做常規出耳試驗［6］。配對組合編號1號：29-7與 29-1；2號：29-7與 29-4；3號：29-7與29-11；4 號：29-7與 29-7；5號：29-7與 29-16。觀察栽培過程中袋內菌絲生長情況、現耳芽情況和出耳情況，確認“黑29”單核菌株交配型。

2 結果與分析

2.1 “黑29”單核菌株表觀形態觀察

圖1 “黑29”單核菌株菌絲生長形態Fig.1“Hei 29”hypha growth morphology of mononuclear strain

在cPDA培養基上，“黑29”單雙核菌株菌絲形態、生長速度、色素產生情況差異都很大。“黑29”雙核菌株菌絲粗壯，氣生菌絲濃密，長速塊。29-7氣生菌絲發達，菌絲非常纖細潔白，菌絲生長速度最快，無色素產生 ；其 余 單 核 菌 株（29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-15、29-16、29-17、29-18）菌絲生長速度慢，菌絲長勢非常弱，氣生菌絲少，培養后期菌絲停止生長，生長過程中色素分泌多（圖1、表1）。由表觀形態可初步將18個“黑29”單核菌株分成兩組，第一組包括29-7，是一種交配型；第二組包括：29-1、29-2、29-3、29-4、29-5、29-6、29-8、29-9、29-10、29-11、29-12、29-13、29-14、29-15、29-16、29-17、29-18 十七個菌株，是另外一種交配型。

表1 單核菌株菌絲生長形態Table 1 Hypha growth morphologyofmononuclear strain

2.2 酯酶同工酶技術檢測“黑29”單核菌株交配型

圖2 “黑29”單核菌株酯酶同工酶電泳圖譜Fig.2 Isodynamic lipoidase electrophoresis map of mononuclear strain

通過酯酶同工酶電泳檢測（見圖2），可知培養15d“黑29”雙核菌株酯酶同工酶酶帶間界限不清，超過了最佳培養時期。所有單核菌株酯酶同工酶酶帶清晰，分辨效果好，所有“黑29”單核菌株只有兩種同功酶形態。“黑29”供試的單核菌株有三條共有酶帶Rf2、Rf6、Rf7。單核菌株 29-1、29-2、29-3、29-4、29-6、29-8、29-11、29-12、29-13、29-15、29-16、29-17、29-18酯酶同工酶譜帶完全一致，屬于一種交配型；單核菌株29-7酯酶同工酶譜帶與其他單核菌株有很大差異（見圖 2、表2、表 3），29-7與其他單核菌相比，缺少Rf1、Rf3、Rf5、Rf8四條譜帶，比其又多出Rf4、Rf9兩條譜帶。可以判定，29-7單核菌株是另一種交配型，這一結果與表觀形態觀察結果一致。

表2 “黑29”單核菌株酯酶同工酶譜Rf值Table 2“Hei 29”Rf value of isodynamic lipoidase electrophoresis

表3 “黑29”單核菌株酯酶同工酶譜Rf值Table 3“Hei 29”Rfvalue ofisodynamic lipoidase electrophoresis

2.3 “黑29”單核菌株回交試驗檢測黑木耳單核菌株的交配型

從18個單核菌中選29-7與29-1、29-4、29-11、29-16兩兩配對接種于cPDA平板。如果兩菌株是屬于不同交配型，兩菌株相互親和，菌絲交匯后應該產生雙核菌株，菌絲生長情況應有所變化；如果兩菌株是屬于同一交配型，兩菌株間不親和，菌絲交匯后生長無變化。

29-7 與 29-1、29-4、29-11、29-16 兩兩配對接種于cPDA平板，25℃下恒溫培養，菌絲交匯后，菌絲生長有明顯變化：菌絲比單核菌株變粗壯濃密、生長速度加快（見圖5、圖6）。而29-7與29-7交匯后菌絲細弱，生長無變化（見圖 3）。29-1、29-4、29-11、29-16四個單核菌株之間兩兩配對后，菌絲交匯后生長無明顯變化，菌絲生長不舒展，生長速度慢，后期停止生長（見圖4）。說明 29-7與 29-1、29-4、29-11、29-16單核菌株交匯后形成了雙核菌株，29-7與29-1、29-4、29-11、29-16不屬于同一種交配型，兩單核菌株親和形成了雙核菌株。而29-7與29-7之間、29-1、29-4、29-11、29-16四單核菌絲之間，兩兩配對生長交匯后未形成雙核菌株，屬于同一種交配型，兩菌株之間不親和。

圖3 29-7＋29-7回交試驗Fig.3 Backcross test of 29-7＋29-7

圖4 29-11＋29-16回交試驗Fig.4 Backcross test of 29-11＋29-16

圖5 29-7＋29-16回交試驗Fig.5 Backcross test of 29-7＋29-16

圖629 -7＋29-11回交試驗Fig.6 Backcross test of 29-7＋29-11

2.4 “黑29”單核菌株回交栽培出耳試驗

菌絲培養階段（見圖 7）：取 29-7與 29-1、29-4、29-11、29-7、29-16兩兩菌株交匯中間部位菌絲重新培養進行常規出耳試驗，接種栽培袋后，培養階段，4號（29-7與29-7回交后菌株）萌發慢，長勢弱，吃料慢；29-11與29-16回交后交匯處菌絲接入栽培袋未萌發未吃料。現耳芽階段：4號無耳芽出現，沒結實。說明配對菌株生長交匯后不親和，未形成雙核菌株。而29-7與 29-1、29-4、29-11、29-16回交后菌株（1號、2號、3號和5號）在菌絲培養階段，菌絲萌發正常，長勢好，吃料快；現耳芽階段：1號、2號、3號、5號均有耳芽產生；出耳階段：1號、2號、3號、5號產生了子實體（見圖8）。說明配對菌株生長交匯后親和，形成雙核菌株。證實 29-7 與 29-1、29-4、29-11、29-16 不屬于一個交配型。

圖7 菌絲培養階段回交菌株生長情況Fig.7 Hypha growth morphology of backcross

圖8 出耳階段回交菌株出耳情況Fig.8 Shooting of backcross strain strain

3 討 論

用纖維素酶制得黑木耳“黑29”原生質體，通過原生質體再生獲得單核菌株，經熒光顯微鏡檢確認“黑29”單核菌株100多株。制備的原生質體兩個核的再生能力差異很大，獲得的100多個單核菌株中有2個菌株屬于一種交配型（29-7），其余菌株均屬于另一種交配型。“黑29”不同交配型的單核菌株菌絲生長勢、菌絲生長速度、色素產生情況有著明顯的差異，黑木耳其他菌株的情況是否如此，有待于進一步研究。

［1］楊新美.中國食用菌栽培學［M］.北京：農業出版社，1988:150-151.

［2］楊新美.食用菌研究法［M］.北京：中國農業出版社，1998:5-8.

［3］羅信昌，陳大年.食用菌核熒光染色技術的研究［J］.真菌學報，1990，9（1）：64-68.

［4］何培新，申進文，羅信昌，等.木耳孢子單核菌株培養性狀多態性研究［J］.食用菌學報，2003，10（2）：1-4.

［5］韓增華，張介馳，戴肖東，等.黑木耳液體菌絲球長期保藏菌種性狀研究［J］.食用菌，2007，29（1）：21-22.

［6］孔祥輝，王玉江，張丕奇.北方代料栽培黑木耳與猴頭的關鍵技術［M］.哈爾濱：黑龍江科學技術出版社，2005:1-117.