七味通痹口服液治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理研究

殷書梅，王 宓，林新艷，李吉峰 ，儲(chǔ)益平

(1.江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇 南京 210046; 2.常州盛輝藥業(yè)有限公司，江蘇 常州 213000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜為主要靶組織的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病。在RA自然病程中，5～10年致殘率為60%，30年為90%。RA患者的平均壽命縮短10～15年，而伴關(guān)節(jié)外表現(xiàn)者的5年生存率僅為50%。因此，RA被看作和Ⅳ期淋巴瘤、冠狀動(dòng)脈病變有相似嚴(yán)重預(yù)后的疾病[1]。七味通痹口服液的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，其能明顯抑制弗氏完全佐劑所致大鼠致炎側(cè)和對(duì)側(cè)后肢(因遲發(fā)性超敏反應(yīng)引起)的腫脹，降低大鼠前肢、耳部、尾部結(jié)節(jié)的發(fā)生率，降低大鼠血漿前列腺素E2、血清白細(xì)胞介素-1(IL-1)水平;組織病理學(xué)檢查結(jié)果也表明，其能夠減少大鼠踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)分泌物、關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜炎癥和關(guān)節(jié)外軟組織炎癥的關(guān)節(jié)數(shù)。為了進(jìn)一步探討七味通痹口服液治療RA的作用機(jī)理，筆者擬從抗炎和免疫兩個(gè)方面觀察，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

DK-8B型恒溫浴槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);UV2401 PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津制作所，P/N:206-82201-93);AR2140型電子分析天平(奧賽斯國(guó)際貿(mào)易〈上海〉有限公司)。七味通痹口服液(江蘇南星藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為070102);正清風(fēng)痛寧(湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)為0709112);2，4-二硝基氯苯(DNCB，南京玖泰化學(xué)試劑廠，批號(hào)為20010504);丙酮(上海化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)為200608032)。ICR小鼠，SD大鼠，均由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證為SCXK(蘇)2007-0001。

1.2 方法

小鼠血清溶血素試驗(yàn):取ICR小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，左旋咪唑組，正清風(fēng)痛寧組，七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組10只。各給藥組小鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對(duì)照組灌胃給予蒸餾水，灌胃容積均為10 mL/kg，每日1次，共10 d。給藥第3天，對(duì)每只小鼠用20%綿羊紅細(xì)胞(SRBC)腹腔注射0.2 mL致敏，末次灌胃給藥后24 h，從小鼠眼眶取血0.5 mL，常規(guī)分離血清。于96孔微量血凝板上將血清作倍比稀釋，每孔 50 μL，再于每孔中加入 50 μL 1%SRBC，混勻，置 37 ℃烘箱中3 h，觀察紅細(xì)胞凝集程度[2-3]，計(jì)算各組小鼠的血清抗體積數(shù)。再取ICR小鼠60只，操作同上，在致敏后的第4天和第6天每只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)30 mg/kg(正常對(duì)照組小鼠除外)。計(jì)算各組小鼠的血清抗體積數(shù)。抗體積數(shù)=(S1+2S2+3S3+……+n Sn)，式中1，2，3……n代表倍比稀釋的指數(shù)，S表示凝集程度的級(jí)別，抗體積數(shù)越大，表示血清中抗體水平越高。0級(jí)為紅細(xì)胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點(diǎn)狀，四周液體清晰;Ⅰ級(jí)為紅細(xì)胞大部分下沉在孔底成圓點(diǎn)狀，四周有少量凝集的紅細(xì)胞;Ⅱ級(jí)為凝集的紅細(xì)胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見(jiàn)到1個(gè)疏松的紅點(diǎn);Ⅲ級(jí)為凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見(jiàn)1個(gè)小紅點(diǎn);Ⅳ級(jí)為凝集的紅細(xì)胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時(shí)成卷折狀。

小鼠遲發(fā)性超敏(DTH)反應(yīng)試驗(yàn):取ICR小鼠50只，體重18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，即模型組，正清風(fēng)痛寧組，七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組10只。各組分別給予7%的DNCB丙酮溶液0.02 mL/只背部皮下注射致敏。給藥組按20 mL/kg每日灌胃給藥1次，連續(xù)10 d。末次灌胃給藥后30 min，小鼠右耳涂以1%DNCB麻油溶液0.03 mL激發(fā)。24 h后處死動(dòng)物，剪下左右兩耳，用打孔器(直徑9 mm)分別在同一部位取下圓耳片，電子天平稱重，計(jì)算小鼠耳廓腫脹度(小鼠右耳廓重與左耳廓重的差值)，并計(jì)算腫脹百分率(腫脹度/左耳重)。再取ICR小鼠60只，操作同上，在致敏期間并不給藥，僅在激發(fā)后1 h和13 h時(shí)灌胃給藥2次，計(jì)算小鼠耳廓腫脹度，并計(jì)算腫脹百分率[4-6]。

小鼠印度墨汁巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn):取ICR小鼠60只，雌雄各半，體重18～22 g，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組，左旋咪唑組，正清風(fēng)痛寧組，七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠分別灌胃給予受試藥物，每日1次，共10 d。末次給藥后30 min，按每10 g體重0.1 mL尾靜脈注射20%印度墨汁，注射后2，10 min用吸管(預(yù)先用肝素溶液潤(rùn)濕)分別從眶后靜脈叢取血20 μL，溶于2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，搖勻，置分光光度計(jì)，于650 nm波長(zhǎng)下比色，測(cè)定吸光度(A)。將小鼠脫頸椎處死，分別稱取肝、脾質(zhì)量，計(jì)算炭粒廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(a)[7-8]。

K=(log OD2min-logOD10min)/(t10-t2)

a=體重(g)×K1/3/肝脾質(zhì)量(g)

大鼠紐扣肉芽腫試驗(yàn):取雄性SD大鼠60只，體重150～180 g，隨機(jī)分為6組，即模型組，阿司匹林組，正清風(fēng)痛寧組，七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組10只。以4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰臥位固定大鼠，腹部去毛，用碘酒和酒精消毒后，腹部正中切開(kāi)，向兩側(cè)腹股溝做一隧道，將兩枚紐扣(浸泡在75%乙醇中消毒)分別放入兩側(cè)腹股溝處，縫合切口。切口常規(guī)消毒，整個(gè)手術(shù)過(guò)程注意無(wú)菌操作。除模型組外，其余各組大鼠分別給予受試藥物，每日1次，共10 d。于末次給藥后24 h，處死大鼠，取出肉芽組織，稱取肉芽組織的濕重;然后將肉芽組織放入80℃烘箱中烘24 h，取出，稱取肉芽組織干重。比較各組間的差異，并計(jì)算抑制率[9-10]。

抑制率(%)=(對(duì)照組肉芽干重-給藥組肉芽干重)/對(duì)照組肉芽干重×100%。

去腎上腺大鼠足趾腫脹試驗(yàn):取雄性SD大鼠70只，體重130～150 g，乙醚淺麻醉后，摘除雙側(cè)腎上腺，術(shù)后喂飼糖鹽水。手術(shù)后第3天將挑選手術(shù)成功大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即模型組，阿司匹林組，正清風(fēng)痛寧組，七味通痹口服液低、中、高劑量組，每組10只。另取10只大鼠，不切除腎上腺，給予七味通痹口服液中劑量，作為七味通痹對(duì)照組。除模型組外，其余各組大鼠分別給予相應(yīng)受試藥物，每日1次，共5 d。末次給藥后1 h，將大鼠后肢拉直，用26號(hào)針頭先自足趾中部皮下向上注入一部分致炎劑(1%角叉菜膠0.1 mL)，然后調(diào)轉(zhuǎn)針頭向下注射完，分別于注射致炎劑前及注射后1，2，4，6 h時(shí)用測(cè)厚儀測(cè)定大鼠足趾的厚度，比較各組間的差異[9，11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清溶血素試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)于免疫正常的小鼠，各劑量的七味通痹口服液均可降低小鼠血清抗體積數(shù)，其中中、高劑量組小鼠血清抗體積數(shù)顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05或 P＜0.01)，其表現(xiàn)出了一定的體液免疫抑制作用。但是，當(dāng)預(yù)先腹腔注射CTX導(dǎo)致小鼠免疫功能低下時(shí)，各劑量的七味通痹口服液又具有一定的升高血清溶血素作用，其中高劑量組小鼠血清抗體積數(shù)顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，表明其對(duì)免疫低下小鼠具有一定的體液免疫增強(qiáng)作用。

表1 七味通痹口服液對(duì)小鼠血清溶血素的影響(，n=10)

表1 七味通痹口服液對(duì)小鼠血清溶血素的影響(，n=10)

注:與正常對(duì)照組相比，△P＜0.05，▲P＜0.01(表 3同)。

組別 劑量(g/kg)抗體積數(shù)正常對(duì)照組左旋咪唑組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低-中高0.10.0471428正常小鼠133.8±55.5183.0±38.6△91.8±27.5△112.7±33.091.3±30.1△73.5±21.7▲免疫低下小鼠47.2±22.1107.3±27.8▲39.5±25.262.7±34.167.5±28.772.3±28.8△

2.2 小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表2。致敏后給藥(第1天至第10天)，七味通痹口服液對(duì)DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)具有顯著的抑制作用，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01);但在激發(fā)后給藥兩次(第10天和第11天)，七味通痹口服液卻不能對(duì)抗由DNCB誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。

2.3 小鼠印度墨汁巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表3。中、高劑量七味通痹口服液可升高小鼠炭粒廓清指數(shù)(K)和矯正廓清指數(shù)(a)，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表明七味通痹口服液具有一定的非特異性免疫增強(qiáng)作用。

表2 七味通痹口服液對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響(，n=10)

表2 七味通痹口服液對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響(，n=10)

注:與模型組相比，□ P ＜0.05，■ P ＜0.01(表 4-6同)。

組別 劑量(g/kg)耳廓腫脹度(g) 腫脹抑制率(%)模型組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低-中 高0.0471428激發(fā)前給藥3.05±1.060.86±0.48■1.51±1.07■0.69±0.29■0.56±0.43■激發(fā)后給藥3.27±1.962.74±1.473.51±2.143.30±1.933.07±1.78激發(fā)前給藥19.47±7.365.50±2.66■10.20±8.32□4.45±1.91■3.70±3.32■激發(fā)后給藥21.78±14.6618.12±10.1723.14±15.8221.89±13.92320.33±12.82

表3 小鼠印度墨汁巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果(，n=10)

表3 小鼠印度墨汁巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果(，n=10)

組別正常對(duì)照組左旋咪唑組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低中高劑量(g/kg)-0.10.0471428炭粒廓清指數(shù)(K)0.050±0.0180.108±0.0470.056±0.0440.059±0.0200.082±0.040△0.080±0.031△吞噬指數(shù)(a)7.755±1.3739.986±2.0147.730±0.9518.820±1.9429.211±1.9399.270±1.127△

2.4 大鼠紐扣肉芽腫試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表4。各劑量七味通痹口服液均可降低肉芽組織的濕重和干重，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。

表4 七味通痹口服液對(duì)紐扣肉芽腫的影響(，n=10)

表4 七味通痹口服液對(duì)紐扣肉芽腫的影響(，n=10)

組別模型組阿司匹林組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低中 高劑量(g/kg)-0.150.0471428濕重(mg)815.2±286.1364.3±76.2■511.2±162.2■477.3±88.8■464.1±234.6■426.3±113.3■干重(mg)251.4±63.1154.0±60.9■196.0±27.6□186.9±40.9□186.4±64.7□178.9±35.1□干重抑制率(%)-38.722.025.725.828.8

2.5 去腎上腺大鼠足趾腫脹試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表5、表6。對(duì)于未去腎上腺的大鼠，七味通痹口服液對(duì)角叉菜膠誘發(fā)的大鼠足趾腫脹具有較強(qiáng)的抑制作用;對(duì)于去腎上腺大鼠，七味通痹口服液對(duì)角叉菜膠誘發(fā)的大鼠足趾腫脹仍有一定的抑制作用，但作用強(qiáng)度有所降低。

表5 七味通痹口服液對(duì)大鼠足趾厚度的影響(mm，，n=10)

表5 七味通痹口服液對(duì)大鼠足趾厚度的影響(mm，，n=10)

組別 注射前劑量(g/kg)注射后模型組阿司匹林組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低-中 高對(duì)照組0.150.0471428145.15±0.285.11±0.225.12±0.165.07±0.215.10±0.145.11±0.264.99±0.241 h 5.58±0.195.54±0.205.73±0.315.44±0.125.56±0.315.57±0.395.21±0.21■2 h 5.83±0.255.49±0.24■5.62±0.245.57±0.345.63±0.265.61±0.235.45±0.32■4 h 6.36±0.275.86±0.41■6.16±0.306.01±0.37□5.98±0.35□5.86±0.22■5.58±0.44■6 h 6.49±0.256.02±0.21■6.31±0.196.22±0.456.22±0.18□6.18±0.27□5.69±0.44■8 h 6.53±0.176.00±0.31■6.31±0.316.14±0.55□6.27±0.26□6.24±0.20■5.74±0.46■

表6 七味通痹口服液對(duì)大鼠足趾腫脹抑制率的影響(%，，n=10)

表6 七味通痹口服液對(duì)大鼠足趾腫脹抑制率的影響(%，，n=10)

組別 劑量(g/kg)注射后模型組阿司匹林組正清風(fēng)痛寧組七味通痹組低-中 高對(duì)照組0.150.0471428141 h 8.66±5.038.48±6.5212.04±7.457.49±4.728.99±5.909.07±5.054.34±1.68□2 h 13.50±4.857.56±5.42□10.04±6.6310.04±7.4510.49±5.0010.07±4.499.11±2.89□4 h 23.92±8.1414.71±9.80□20.45±7.3018.71±6.2317.19±5.53□15.02±7.09□11.66±5.25■6 h 26.52±9.5817.96±7.03□23.39±5.4922.83±9.2522.12±5.1421.17±7.0213.76±4.99■8 h 27.33±8.0617.51±7.59□23.45±7.7721.32±10.9723.02±5.9022.44±7.7214.82±5.31■

3 討論

20世紀(jì)80年代，對(duì)細(xì)胞因子的研究使得T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)成為RA發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)，而且針對(duì)T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的治療取得了一定成效。RA患者滑膜組織浸潤(rùn)的T細(xì)胞多為CD4+和 CD45RO+記憶型細(xì)胞，具有 α， βTCR，表達(dá) HLA-DR，CD69，VLA-1(很晚出現(xiàn)的抗原-1)及輔助刺激分子CD28，且A型滑膜細(xì)胞(Mφ型)表達(dá)HLA-DR、輔助刺激分子CD80(B7)及CD86(B70)。滑膜組織的T細(xì)胞接受抗原刺激而活化[12]。吳福國(guó)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血CD4+細(xì)胞與正常人比較無(wú)明顯變化，而CD8+細(xì)胞明顯減少，活化T細(xì)胞明顯升高，表明細(xì)胞免疫處于亢進(jìn)狀態(tài)。T細(xì)胞處于激活狀態(tài)，對(duì)RA病理的持續(xù)發(fā)展起重要作用[14]。遲發(fā)性超敏(DTH)是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以此可觀察藥物對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫的影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，首先用特定的抗原致敏動(dòng)物，等一段時(shí)間后再次給予相同的抗原激發(fā)，再測(cè)定激發(fā)部位皮膚的厚度等來(lái)觀察遲發(fā)性超敏的發(fā)生[4]。七味通痹口服液在致敏后開(kāi)始給藥，激發(fā)后停止給藥，對(duì)遲發(fā)性超敏具有顯著的抑制作用;在致敏后不給藥，在激發(fā)后給藥兩次，抑制作用消失。這提示七味通痹口服液對(duì)機(jī)體中抗原的提呈以及效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞的形成具有抑制作用，而對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞再次接觸抗原后引起的炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞毒作用無(wú)明顯作用。

RA患者體內(nèi)存在大量的自身抗體，與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物在RA滑膜炎癥及關(guān)節(jié)外表現(xiàn)中起到了重要作用。另外，在對(duì)RA滑膜的病理研究中發(fā)現(xiàn)，滑膜中存在B細(xì)胞濾泡和生發(fā)中心形成以及大量漿細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明B細(xì)胞參與了滑膜炎癥的形成。有研究表明，RA患者血清免疫球蛋白(IgA，IgG，IgM)、補(bǔ)體C3水平顯著高于正常對(duì)照組，提示RA患者體液免疫功能也處于亢進(jìn)狀態(tài)[15-16]。由本研究結(jié)果可知，七味通痹口服液具有一定的免疫增強(qiáng)作用和非特異性免疫增強(qiáng)作用，表明其對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用。考慮到改變病情藥物(DMARD)和一些單抗類藥物常會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)的過(guò)分被抑制，使機(jī)體出現(xiàn)感染等副作用，若同時(shí)使用七味通痹口服液，利用其對(duì)免疫的雙向調(diào)節(jié)作用，有望顯著減輕這些副作用。另外，本研究結(jié)果還表明，七味通痹口服液的抗炎作用與垂體-腎上腺軸有關(guān)，但并不完全依賴于垂體-腎上腺軸。

七味通痹口服液對(duì)免疫系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)作用以及抗炎作用，可能是其治療RA的作用機(jī)制之一。近期研究表明，輔助性T細(xì)胞(help T cell，Th)亞群1和亞群2(Th1/Th2)細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子的水平失衡與RA的發(fā)生密切相關(guān)[17]。因此，七味通痹口服液對(duì)輔助性T細(xì)胞的影響及其對(duì)免疫系統(tǒng)作用的機(jī)理等還有待進(jìn)一步研究。

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