豬肺炎支原體p97 R1區基因和大腸桿菌LTB基因的重組和表達

盧會英,沈青春,寧宜寶

(中國獸醫藥品監察所農業部獸藥創新與生物安全評價重點開放實驗室,北京 海淀 100081)

豬支原體肺炎在我國20世紀40年代就有散在發生,1953年開始流行,以后蔓延全國,造成重大經濟損失[1]。豬肺炎支原體在呼吸道定居是通過特定結合到黏膜上皮細胞的纖毛上完成的。開始支原體粘附在完整的氣管纖毛表面,爾后逐漸殘蝕纖毛,直至造成纖毛大面積的或全部脫落[2]。這種相互間的作用經研究發現與纖毛粘附因子有關。張啟敬(1995)[3]發現單克隆抗體(MAbF2G5)和(MAbF1B6)可抑制豬肺炎支原體粘附在豬氣管的纖毛上。這兩個單抗可以識別p97蛋白,純化的p97蛋白可結合在纖毛上抑制豬肺炎支原體的粘附[4-5],最后證明了97 k D的膜蛋白p97為纖毛粘附因子。單克隆抗體MAbF 1B6為纖毛阻斷抗體它識別p97基因中的重復序列區R1區,所以說明R1區為p97蛋白中的主要抗原決定區[6]。結合豬肺炎支原體的免疫學特點,主要引起的是黏膜免疫和細胞免疫,其中黏膜免疫在控制該病的發生中起著重要的作用[7],如果使用的疫苗可以引起機體產生很高的黏膜免疫水平就可以很好的保護黏膜系統,對阻斷豬肺炎支原體的侵入有很大的幫助。目前研究發現,產腸毒素大腸桿菌的不耐熱腸毒素B亞單位是有效的黏膜免疫佐劑,因此此試驗設計將LTB序列和R1序列進行重組表達,然后觀察此重組蛋白的免疫原性以及其對機體的黏膜免疫水平的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒 國際標準豬肺炎支原體232株和產腸毒素大腸桿菌C83901均由中國獸醫藥品監察所保存。pMD18-T載體,p ET 28-a(+)原核表達載體,大腸桿菌BL21(DE3)和TOP10感受態細胞本實驗室保存。

1.2 主要試劑 高保真DNA合成酶pfu購自S tratagene公司,Taq DNA聚合酶購自鼎國生物公司,限制性核酸內切酶購自NEB公司,T 4連接酶購自TaKaRa公司,質粒提取試劑盒購自OMEGA公司,凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司,2×YT培養基,預染蛋白 Marker購自NEB公司,DNA Marker DL-2000和DL-15000購自TIANGEN公司。

1.3 血清 抗豬肺炎支原體232株的兔高免血清由本實驗室制備保存。HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自Sigma公司。

1.4 目的片段R1和LTBR1的擴增 分別以國際標準菌株232的全基因序列和產腸毒素大腸桿菌全基因序列為模板,根據GenBank發布的 p97基因(U50901)和LTB基因序列(M17873)設計擴增目的片段R1和LTBR1的引物:

分別在片段R1和LTBR1的兩端引入了酶切位點Bam HⅠ和Hin dⅢ,對應于表達載體p ETa-28(+)中的插入位點。

LTB與R1片段的融合片段LTBR1的擴增采用的為重疊延伸PCR的方法。

1.5 pMD18-T-rR1和 p MD18-T-rLTBR1克隆質粒的構建 將PCR擴增的目的片段進行純化回收后進行加A,回收的片段通過T 4DNA Ligase連接到pMD18-T載體上。得到了質粒pMD18-T-rR1和pMD18-T-rLTBR1。然后轉化到克隆性感受態細胞TOP 10中。通過抗性篩選和菌落PCR的方法得到陽性菌落,然后對陽性菌落進行質粒提取和酶切鑒定最后進行測序。將測序正確的菌株進行保菌,放于-70℃冰箱保存。

1.6 p ET-28a(+)-rLTBR1和p ET-28a(+)-rR1表達質粒的構建 對上述陽性質粒進行Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切,回收酶切片段,同樣對p ET-28a(+)空載體進行Bam HⅠ和Hin dⅢ雙酶切,然后連接酶切后的目的片段和表達載體,將連接產物轉化到克隆性感受態細胞 TOP 10中,通過卡那抗性和質粒鑒定的方法篩選出陽性菌落,然后提取質粒進行酶切鑒定,鑒定正確后將質粒轉化到表達宿主菌BL21(DE3)中。同樣通過卡那抗性篩選和提取質粒后酶切鑒定的方法得到陽性菌落,然后進行測序。將測序正確的菌株保菌,放于-70℃冰箱保存。

1.7 重組菌的誘導表達及鑒定 誘導表達按照Novagen的p ET系統操作手冊進行:將 p ET-28a(+)-rLTBR1和p ET-28a(+)-rR1表達質粒分別轉化到BL21(DE3)的宿主菌中,37℃過夜振蕩培養,取適量菌液(一般為1‰比例)接種于含50μg/m L卡那霉素的2×YT液體培養基中,37℃振蕩培養至對數生長期(OD600 nm=0.6),然后加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/m L。在30℃低溫誘導培養5 h。同時設立p ET-28a(+)空載體的受體菌和未誘導對照。對誘導的目的蛋白進行SDS-PAGE分析,按照文獻(分子克隆實驗指南)[8]進行:離心收集菌體,然后PBS洗滌一次,其中一半按照1∶20體積加入裂解液重懸菌體進行裂解,其中加入1 mg/m L溶菌酶和 5μg/m L的蛋白酶抑制劑PMSF,冰上作用30 min后,進行超聲波破碎,工作5 s間隔5 s,200次重復。然后離心得到上清和沉淀,分別取樣加入等體積的2×凝膠上樣緩沖液。另一半取一定的樣品直接取沉淀加入等體積的2×凝膠上樣緩沖液,這兩份樣品煮沸3～5 min。然后12000 r/min離心 10 min。進行 Tricine SDSPAGE電泳檢測。然后進行考馬斯亮藍染色1～2 h,之后加入脫色液脫色至條帶清晰。對鑒定正確的蛋白進行0.22μm NC膜的濕轉,然后進行Western blot分析。免疫印跡 Western blot試驗步驟(參考分子克隆實驗指南[8]):電轉后的膜用5%脫脂奶粉進行封閉4℃過夜,然后以兔抗Mhp的高免血清作為一抗,以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗,分別于37℃孵育1 h,作用后用PBS洗滌 3次,然后用DAB進行顯色,觀察分析結果。

1.8 誘導蛋白的純化和蛋白定量 所表達的目的蛋白為帶有 His標簽的融合蛋白,所以采用Ni-N TA His.Bind Resin進行親和層析純化,按照Novagen公司的Ni-NTA His.Bind Resin說明書進行操作。使用Nano Drop ND-1000 spectrophotometer在280 nm波長下進行蛋白定量。

2 結果

2.1 目的片段擴增 PCR方法擴增R1片段和LTB以及重組片段LTBR1得到了大小分別為280 bp,320 bp,600 bp的目的片段。將目的片段插入到p MD18-T載體和pET-28a(+)表達載體,分別對陽性菌落進行酶切鑒定和測序,鑒定和測序結果完全正確。

2.2 目的蛋白的誘導表達和純化 對轉化了表達質粒p ET-28a(+)-LTBR1和p ET-28a(+)-R1的宿主菌進行誘導,分別表達得到了30 k D和17 kD大小的目的蛋白。經過對誘導產物的表達水平和可溶性分析,結果是目的蛋白占菌體總蛋白量的37%,R1蛋白主要是可溶性表達,LTBR1蛋白以包涵體形式表達。Western blot檢測結果表明,表達的目的蛋白能夠與兔抗Mhp的高免血清結合。

3 討論

R1區是纖毛粘附因子p97粘附纖毛的主要決定區,該區的功能通過結合纖毛的單克隆抗體F 1B6進行了驗證。該蛋白免疫動物如果產生的主要為黏膜抗體,就可以很大程度的保護黏膜系統,阻斷支原體與黏膜的粘附作用,從而減少支原體感染。結合當前黏膜免疫佐劑的研究進展,發現LTB作為黏膜免疫佐劑在黏膜免疫中起著重要的作用,并且這種方法在許多主要以侵襲黏膜致病的病原體的研究中得到了應用[9]。因此設計重組表達了融合蛋白rLTBR1,目的在于研究該蛋白作為免疫原免疫動物后起到的免疫保護作用如何,LTB與R1共同作用是否提高了機體的黏膜免疫水平。本試驗構建的重組菌表達的蛋白通過SDS-PAGE和Western blot試驗分析,rR1和 rLTBR1蛋白均為特異性蛋白。本試驗為開發有效的提高黏膜免疫水平的基因工程疫苗研究打下了基礎。

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