高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位預測

郭 楊,林 華,郭宇飛,郭萬柱

(1.四川農業大學動物生物技術中心,四川雅安625014;2.四川出入境檢驗檢疫局,四川成都610041;3.金陵科技學院動科院,江蘇 南京 200038)

高致病性豬藍耳病是由一種帶有Nsp2部分缺失的、對豬呈高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的疫病[1-3]。豬是惟一的感染動物。本病沒有明顯的季節性,一年四季均可發生。主要發生在惡劣氣候條件和飼養環境下。高度傳播性、污染性是高致病性PRRSV的一個突出特征。與經典毒株相比,病原的基因序列變化主要是在Nsp2區缺失了30個氨基酸。故有學者認為病毒基因的缺失使其毒力明顯增強,決定了其極強的致病性,經典毒對豬沒有流行毒如此高的致死率[4-8]。

1 材料

主要儀器與試劑:質粒小量抽提試劑盒購自O-mega公司;高致病性 PRRSV SC-JX01株、SC-JX01株N sp2重組質粒均由四川農業大學動物生物技術中心保存并提供;高速冷凍離心機:法國Jouan公司;PCR試劑盒:博瑞克生物技術公司產品;DNA分子質量標準:均為TaKaRa公司(大連)產品。

2 試驗方法

2.1 重組質粒的提取 將含有高致病性PRRSV Nsp2基因的重組質粒菌種接種于LB固體培養基,在平板上劃線后于37℃恒溫箱中培養12～16 h,挑取單個白色菌落接種于含Amp 100μg/m L的LB液體培養基中37℃振搖下培養過夜,至對數生長后期。參照質粒小量提取試劑盒說明書進行。

2.2 重組質粒的鑒定 用克隆N sp2基因的上下游引物(引物由林華提供),以重組質粒pMD-Nsp2為模板,進行陽性重組質粒的PCR鑒定。反應體系為50μL,反應程序為:95℃5 min;94℃1 min,56℃1 min,72℃1 min,35個循環;再 72℃7 min,取適量PCR產物電泳鑒定片段大小。挑取單個重組質粒菌株經培養送上海基康生物工程有限公司測序,并與參考序列比較。

2.3 Nsp2基因的序列分析 運用DNAStar軟件對PRRSV不同毒株的Nsp2基因序列進行多序列比對并繪制遺傳進化樹。國內外的參考毒株為[9]:VR2332(A Y150564),16244B(NC-001961),Resp-PRRS MLV株(AF 066183),MLV Resp PRRS/Repro株(AF159149),LV株(M96262),CH1-a株(AY032626)、BJ-4 株(AF331831)、HB-1(sh)/2002株(AY150312)、HB-2(sh)/2002株(AY262352)。已發表的6個高致病性PRRSV毒株[10]為:JXA1株(EF112445)、HEB1株(EF 112447)、HUB2株(EF 112446)、SHH 株(EU 106888)、LN 株(EU 109502)、GD 株(EU 109503)。

2.4 利用DNAStar軟件對SC-JX01株Nsp2基因推導編碼蛋白質氨基酸序列進行親水性、表面可能性和抗原性分析。

3 結果

3.1 重組質粒pMD-Nsp2的鑒定 以質粒DNA為模板,用Nsp2克隆引物擴增出約950 bp左右的條帶,說明插入片段為目的片段。重組質粒提取成功。

3.2 SC-JX01株N sp2基因的序列分析

3.2.1 Nsp2基因的核苷酸序列分析 序列分析結果表明,N sp2基因序列與傳統毒株相比缺失90個核苷酸。與國內分離的高致病性PRRSV毒株的Nsp2基因序列相似性很高為98.1%～99.1%(見圖1);與美洲型標準株VR-2332、疫苗株MLV和早期國內分離的PRRSV經典株的相似性較低。系統發育樹(見圖2)分析表明,SC-JX01株Nsp2序列與國內分離的高致病性PRRSV毒株遺傳距離很近,均屬于PRRSV美洲株;與PRRSV歐洲型LV株的遺傳距離較遠。

3.2.2 Nsp2基因的推導的氨基酸序列分析 與普通PRRSV相比,本試驗獲得的Nsp2基因推導的氨基酸序列變異較大(見圖3),不但存在點突變還存在缺失,共缺失 30個氨基酸。與國內高致病性PRRSV分離株 JXA1株、HEB1株、HUB2株、SHH株、LN株、GD株相比,缺失相同,僅存在少數點突變;SC-JX01株與6個變異毒株高度同源,相似性均大于95.5%,其中 SC-JX01株與 JXA1株、SHH株的相似性最高為98%;但與 VR-2332、MLV株等同源性則較低。

3.3 SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸序列的親水性、表面可能性及抗原性分析結果 通過對Nsp2基因編碼的氨基酸的親水性、表面可及性和抗原性指數進行預測,發現SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸由于第534位～第562位發生缺失,造成親水性區域比VR2332株寬,高抗原指數區域比VR2332株窄(圖4)。序列分析發現,SC-JX01株Nsp2基因編碼的氨基酸所表現的抗原性及其蛋白質表面的 可能性與其親水性區域位點表現出一致的性質。

4 討論

高志強[9]對國內毒株的序列比較結果表明Nsp2區的變異較大,我們選擇擴增的這一區域在Nsp2序列中變異是最大的。此次分離的SC-JX01株Nsp2基因核苷酸序列中一處缺失3 bp;另一處連續缺失87 bp,與6個變異株的Nsp2基因序列高度相似,與早期分離的PRRSV毒株序列差異較大;在獲得的SC-JX01株Nsp2基因推導編碼氨基酸序列也存在2處缺失,這與童光志等[10]研究結果相似。

有學者認為以Nsp2基因的部分缺失為特征的PRRSV對豬是高致病性的[10-11]。從高熱病中分離到的病毒,在Nsp2區域缺失30個氨基酸,同時該病毒引起的較高發病率、病死率,能直接通過Marc-145細胞進行病毒分離,提示Nsp2區域氨基酸的突變與缺失可能改變了PRRSV對細胞或組織的嗜性,或者Nsp2區域氨基酸的缺失與毒力增強有關系。

變異株的Nsp2基因編碼的氨基酸由于第534位-第562位發生缺失,造成親水性和抗原指數與VR2332株比較有非常大的變化。這使PRRSV變異株的致病能力大大加強,SC-JX01株和6個變異株序列特征高度一致,而與以前的毒株又有明顯差異,尤其是N sp2基因的缺失和結構蛋白基因序列的突變,這些變化中哪些對毒力的改變起決定作用還有待進一步的研究[12]。

本研究對克隆的SC-JX01株Nsp2基因進行了序列測定,與美洲型標準株VR2332和變異株等相應序列比較分析,結果顯示此次分離的SC-JX01株Nsp2基因與變6個異株Nsp2基因高度同源,與美洲型標準株VR2332等以前流行的經典型PRRSV Nsp2基因親緣關系都較遠,說明我國現在流行的PRRSV已發生較大的變異,這也可能是用傳統的疫苗免疫無法抵抗高致病性(變異型)豬藍耳病病毒的原因。

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