EGCG對結腸癌細胞RECK基因甲基化以及p38磷酸化的影響

王柏琦 陳艷華

RECK基因是1998年發現的一種新的抑癌基因，它能在轉錄后水平抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的活性[1]，而后者能降解基底膜與細胞外基質(ECM)，從而導致腫瘤細胞轉移。而在腫瘤細胞中，RECK基因幾乎不表達或低表達，而且其啟動子區域通常有異常的甲基化而失活。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是從綠茶中提煉出的一種茶多酚。體外研究表明，它能抑制多種腫瘤細胞的生長[2]。本研究試圖探討EGCG對結腸癌細胞RECK甲基化有何影響，以及與細胞增殖、分化與死亡等多種生理活動的關鍵分子——p38信號通路的激活有何關系。

1 材料和方法

1.1 材料 人結腸癌HT-29細胞株購自中科院上海細胞庫。抗P38磷酸化/非磷酸化單克隆抗體購自Cell signaling，EGCG為Sigma產品(純度98%)，SB203580購自Meck。基因甲基化特異性PCR(MSP)擴增試劑盒購自Chemicon，Wizard DNA純化試劑盒購自Promega，ECL化學發光試劑盒購自Pierce。

1.2 細胞實驗、DNA提取及亞硫酸氫鹽修飾 HT-29于含McCoy’s 5-A和含10%馬血清的培養液(Gibco)中，37℃、5%CO2培養箱中培養。實驗前調整密度為104/ml，隨后與50μM EGCG孵育36h。完畢后用PBS洗滌，加入細胞裂解液及蛋白酶K37℃23h，隨后加平衡酚及氯仿/異戊醇抽提，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預冷的無水乙醇沉淀。用70%乙醇洗滌后收集沉淀DNA并測定DNA含量和純度。亞硫酸氫鹽修飾按照試劑盒提供的方法進行。

1.3 PCR 甲基化特異性RECK基因引物按照參考文獻提供的方法設計[3]，序列由上海生工合成。反應條件：95℃10min預變性后，進入95℃30s，56℃30s，72℃30s的循環，共計40次，末次循環后72℃7min，終止反應。同時選用GAPDH作為內參。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4 Western blot 細胞孵育結束后，加入100～200μl裂解液的比例加入裂解液，充分裂解后，10000rpm離心5分鐘，取10μg蛋白經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉移至硝酸纖維素膜，5%BSA4℃封閉過夜后與抗p38單克隆抗體孵育，經TBST洗膜、孵二抗后ECL顯影。

2 結果

2.1 EGCG能降低HT-29細胞RECK基因啟動子甲基化水平 如圖1所示，HT-29細胞靜息狀態下可檢測出明顯的甲基化條帶(圖1A: lane 1)，當與50μM EGCG孵育36h后，其甲基化水平明顯降低(圖1A: lane 2)，而非甲基化基因有所增高(圖1 B：lane 2)。內參GAPDH在各組中均保持恒定。p38特異性抑制劑SB203580也具有EGCG類似的效果(圖1A、B：lane 3)。

2.2 EGCG能抑制p38磷酸化 HT-29細胞細胞未加入EGCG時，Western blot結果顯示p38具有較高的磷酸化水平(圖2A：lane 1)，當與50μM EGCG孵育36h后，其磷酸化水平明顯降低(圖2A：lane 2)。而總p38在實驗前后保持恒定(圖2B)。

3 討論

在人類探索腫瘤的曲折道路中，腫瘤轉移抑制基因，尤其是抑癌基因甲基化失活是近年來的一大研究熱點。茶多酚是從綠茶中提取的一種多酚化合物，其中主要活性成分為EGCG，它對多種腫瘤，包括胃腸道腫瘤，前列腺癌，宮頸癌，白血病等具有化學預防作用。迄今為止，有關EGCG對結腸癌細胞生物學功能影響方面的研究相對較少。在本研究過程中，我們試圖研究EGCG對結腸癌細胞RECK基因甲 基化是否 具有抑制效 應，并從 腫瘤發生的 重要信號通路p38激酶 出發，探 討EGCG對p38磷酸化有何 影響，為治療結腸癌 尋找一種新 的有效化 療藥物提供 理論基礎 。

圖1 EGCG對HT-29細胞RECK基因啟動子甲基化水平的影響

圖2 EGCG對HT-29細胞p38磷酸化的影響

本研究通過采用MSP法對RECK基因甲基化進行了研究，結果顯示：EGCG處理后的結腸癌HT-29細胞RECK基因啟動子區域的甲基化狀態明顯降低，而非甲基化的RECK基因有所增多，表明EGCG能逆轉腫瘤組織中的RECK甲基化水平。癌變是正常細胞分化異常、增殖過度與凋亡受阻的結果，信號傳導通路的異常在這些過程中起重要作用，其中，生長因子激活的受體酪氨酸激酶傳導通路與細胞的增殖關系密切。P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號傳導通路之一[4]，經EGCG孵育后的結腸癌細胞p38磷酸化水平受到明顯抑制，同時，經p38特異性抑制劑SB203580處理后的HT-29細胞，RECK甲基化情況與EGCG類似，說明在EGCG誘導HT-29細胞表達RECK的過程中，RECK基因的甲基化水平很可能受到p38的調節。EGCG—p38—RECK—MMP這一傳導通路的關系，在EGCG的抗腫瘤過程中很可能具有重要作用。

[1]Takahashi C,Sheng Z,Horan TP,et al.Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998 Oct 27,95(22):13221-13226.

[2]Ho YC,Yang SF,Peng CY,et al.Epigallocatechin-3-gallate inhibits the invasion of human oral cancer cells and decreases the productions of matrix metalloproteinases and urokinase-plasminogen activator[J].J Oral Pathol Med,2007 Nov,36(10):588-593.

[3]Fang MZ,Wang Y,Ai N,et al.Tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate inhibits DNA methyltransferase and reactivates methylation-silenced genes in cancer cell lines[J].Cancer Res,2003 Nov 15,63(22):7563-7570.

[4]Feng Y,Wen J,Chang CC.p38 Mitogen-activated protein kinase and hematologic malignancies[J].Arch Pathol Lab Med,2009 Nov,133(11):1850-1856.