苯酚降解菌CN-6的分離及其生長特性

龍騰銳,張 釗,,莊瑞鑫

(1.重慶大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)與環(huán)境教育部重點實驗室,重慶400045;2.臺灣元智大學(xué)工程學(xué)院化學(xué)工程與材料科學(xué)系,臺灣32003)

苯酚及其衍生物是煤礦開采、石油煉制、煉焦工業(yè)、造紙、塑料、紡織等工業(yè)廢水中的主要排放物質(zhì)[1-2]。研究表明,苯酚是一種毒性物質(zhì),不慎吸、食入,均會對人體健康造成極大傷害,許多酚類更被認為是直接的致癌物質(zhì)。酚的毒性不僅對人類造成傷害,對水生動植物亦是如此,當(dāng)水中苯酚含量達到5～25mg/L時,就會造成魚類的死亡,而酚苯含量大于100mg/L的水若用于灌溉,將會導(dǎo)致農(nóng)作物的減產(chǎn)和枯死[3-4]。所以,各國水體中苯酚的含量都做出了嚴格的限制[5],中國對于污水中酚的排放標準最大限值為2mg/L,而生活飲用水含酚的標準更不可超過0.002mg/L。

目前處理含酚廢水可采取生物降解、萃取、活性炭吸附、高級氧化等方法[5],其中生物降解法不僅安全、經(jīng)濟,而且不會產(chǎn)生2次污染,因此各國學(xué)者在這方面進行了大量研究[6-7]。但生物降解法中的微生物大多是從污泥中馴化得到的菌群,由于菌群內(nèi)的微生物種類繁多、關(guān)系復(fù)雜,給降解機理的研究帶來不便。

該研究從長期受苯酚污染的土壤中篩選、分離到一株降解苯酚能力較高的細菌菌株。該菌株能以苯酚為唯一碳源和能源生長。通過16S rDNA定序確定該菌的菌屬,并對該菌株降解苯酚的生理生化特性和動力學(xué)進行了初步研究,旨在找到一些對酚處理效果較好的優(yōu)勢菌株。

1 材料與方法

1.1 微生物

用于研究的菌株分離自臺灣桃園縣遠東紡織廠污水排放口污泥,由臺灣元智大學(xué)分離技術(shù)實驗室提供,置于-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 化合物及培養(yǎng)基

苯酚、甲醇、甲酸為德國MerckChemicals公司產(chǎn)品,所有藥品純度均超過 99%。實驗用水為Millipore公司Milli-Q制備的超純水。

NB培養(yǎng)(基)液:牛肉浸膏3.0 g/L;蛋白胨5.0 g/L;固態(tài)培養(yǎng)基另含瓊脂15.0 g/L。

MS培養(yǎng)液:礦物質(zhì)鹽培養(yǎng)液采用 Hutner'smineral Base[8],每1 L培養(yǎng)液中含有KH 2PO45.44 g;Na2 HPO45.65 g;(NH 4)2 SO4 1.00 g;Nitrilotriacetic acid 0.20 g;MgSO40.29 g;CaCl2?2H2O 0.07 g;(NH 4)6Mo7O24?4H2 O 0.2mg;FeSO4?7H2 O 8.3mg;EDTA 3.1mg;ZnSO4?7H 2O 13.7mg;MnSO4?7H2O 1.9mg;CuSO4?5H2O 0.5mg;Co(NO3)2?6H 2O 0.3mg;Na2B4 O7?10H2 O 0.2mg。初始pH 值為7.2±0.5。

1.3 分離和降解培養(yǎng)試驗

富集培養(yǎng):將10 g紡織污水排口污泥加入100mL NB培養(yǎng)液中攪拌靜置,取上清液作為接種液。在250mL培養(yǎng)瓶中加入100mLmS培養(yǎng)液、2mL接種液、苯酚(100mg/L)作為唯一碳源,將培養(yǎng)瓶置于水浴搖床中(30℃±0.5℃,120 rpm)培養(yǎng)。富集的菌液約每兩天轉(zhuǎn)接1次,每次將5mL前次富集的菌液轉(zhuǎn)接到含有100mL新鮮MS培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,同時將苯酚的濃度從100mg/L增加到200mg/L,如此轉(zhuǎn)接10次。

菌株分離:將富集得到的培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接到NB固態(tài)培養(yǎng)基上,劃線分離純化,置于30℃±0.5℃下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),如此重復(fù)直至得到純菌株。

苯酚降解試驗:在100mL無菌MS培養(yǎng)液中加入2mL含有純菌株的磷酸鹽緩沖液作為接種菌,將不同濃度的苯酚作為唯一的碳源加入無菌MS培養(yǎng)液,置于水浴搖床中(30℃±0.5℃,120 rpm)培養(yǎng),研究CN-6在不同初始濃度苯酚條件下的降解特性。PH、溫度、溶氧量試驗是將300mg/L的苯酚作為唯一碳源加入培養(yǎng)液中,改變PH、溫度、水浴搖床晃動速度來了解CN-6在相應(yīng)環(huán)境中對苯酚的降解特性,培養(yǎng)條件同上。每個降解試驗做3個平行樣品,間隔1 h進行無菌操作取樣,測定生物量和苯酚濃度。

1.4 分析方法

苯酚濃度:高效液相色譜(HPLC)法。取1mL樣品加入0.25mL HCl(3mol/L),均勻混合后,經(jīng)孔徑為0.2μm的Millipore針筒濾膜過濾后,用高效液相色譜儀在254 nm波長用外標法進行定量。液相色譜儀為日本 JASCO 975型,色譜柱為美國Phenomenex Synergi 4(Polar-RP(150mm×4.6mm,4μm)),流動相為甲醇與水的混合物,按6:4(V/V)配制(含 0.1%的甲酸),流速1.5mL/min,柱溫30℃,進樣量10μL。

生物量:比濁法,采用JASCO公司V-550型紫外線-可見光光譜儀在 600 nm下測定光密度值(OD600)。

1.5 16SrDNA測序分析和菌種鑒定

將細菌接種于NB培養(yǎng)液中進行12 h培養(yǎng)后,取 1mL培養(yǎng)液,使用 Genomic DNAmini kit Geneaid純化DNA,采用其標準流程得到genomic DNA,并在-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

用于PCR反應(yīng)的引物為M 13F(-20)5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'和M 13R(-24)5'-AAC AGC TAT GAC CAT G-3'。PCR反應(yīng)體系:50μL PCR混合物中包含細菌DNA 1μL,10 μmol/L引物各 1μL,PCR緩沖液 5μL(PH8.3 Tris-HCl 10mmol/L,KCl 50mmol/L,MgCl2 2mmol/L,0.01%gelatin),2.5mmol/L dNTP1 μL,Taq聚合酶 0.5μL。PCR反應(yīng)條件:94℃10min,55℃1min,72℃2min擴增35個循環(huán),最后在72℃保溫延伸10min。純化后的PCR產(chǎn)物,由臺灣明欣生物科技公司使用ABI Prism 3730型基因分析儀定序。用電子掃描電鏡觀察菌體形態(tài)特征,并用16S rDNA法進行細菌鑒定。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲取的CN-6菌株16S rDNA序列在NCBI上進行 BLAST分析比對,選取相關(guān)序列(皆為Pseudomonas屬),再利用DNAman進行多重序列比對(Multialignment),然后構(gòu)建發(fā)育樹(Distancemethod選取Kimura,BootstraPtrials 1 000次)。

4.2.3 構(gòu)建統(tǒng)一的聯(lián)合標準和完善的服務(wù)體系。由于圖書館配產(chǎn)業(yè)成員來自天南海北的出版社、館配商及各大高校圖書館和省市地區(qū)公共圖書館等，各行業(yè)所運用的辦公系統(tǒng)和工作標準不一,導(dǎo)致圖書信息的傳遞、轉(zhuǎn)換、利用受限，給圖書采訪工作帶來諸多不便，因此建立高度統(tǒng)一的信息傳遞標準和完善的聯(lián)合體系是跨領(lǐng)域的多方合作亟需解決的重要問題。

1.7 生長動力學(xué)

利用CN-6在不同初始濃度下的降解數(shù)據(jù),作出生長曲線。計算每組實驗對數(shù)生長期中生長曲線的斜率,推估出不同初始酚濃度下的比生長速率,并用不同比生長速率值對不同初始酚濃度做圖,選擇合適的動力學(xué)模型,在MATLAB 7.0中對數(shù)據(jù)點進行非線性回歸,得出各動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

通過富集培養(yǎng),從污泥中分離得到1株純菌種,可利用苯酚為唯一碳源和能源獨立生長于培養(yǎng)基中,暫命名為CN-6。CN-6在固態(tài)NB培養(yǎng)基上菌落無色透明,菌落中心略高于周圍邊緣。挑取單菌落,利用掃描電鏡進行個體觀察,細胞呈桿狀(圖1),革蘭氏染色呈陰性,氧化酶為陽性和過氧化氫酶為陰性。

圖1 CN-6掃描電鏡圖(7 000×)

利用菌株16S rDNA特異引物進行PCR擴增,得到約1.5 kb的擴增產(chǎn)物(圖2)。DNA測序后,與GenBank細菌序列庫中序列進行同源性比對,CN-6與假單胞菌屬的多株細菌相似性均在90%以上,其中與Pseudomonas sp.Hg4-06(EU304252.1)相似系數(shù)高達 98%。根據(jù) 16S rDNA的序列,Pseudomonas sp.CN-6的系統(tǒng)非根狀發(fā)育樹(圖3)。

2.2 Pseudomonas sp.CN-6對不同濃度苯酚的降解

將CN-6菌株接種在PH 7.0,苯酚質(zhì)量濃度分別為30mg/L,60mg/L,100mg/L,150mg/L,200mg/L,300mg/L,400mg/L,500mg/L,600mg/L和1 000mg/L的MS培養(yǎng)液中,初始接種生物量為0.05～0.08 OD,將其置于水浴搖床中(30℃±0.5℃,120 rpm)培養(yǎng)24 h,持續(xù)測定細菌的生長和苯酚降解情況,結(jié)果見圖4。

圖2 16Sr DNA PCR擴增

圖3 CN-6系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 濃度對CN-6菌株降解苯酚的影響

從圖4中可知,在初始苯酚濃度不大于 500mg/L的培養(yǎng)液中,細菌生長較快,苯酚的小時平均降解速率隨底物濃度增大而加快,由圖5所示,300mg/L、PH 7.0時,完全降解苯酚耗時9.5 h,平均每小時降解33.05mg/L苯酚,比降解速率大,降解苯酚能力明顯高于文獻記載[9-11],但遲滯期較長;在400～500mg/L時,細菌生長速度和苯酚降解速率略有下降,但苯酚均能完全降解;當(dāng)苯酚高于500mg/L,細菌生長受到抑制降解能力迅速下降,在24 h內(nèi)無法完全降解培養(yǎng)液中的苯酚;當(dāng)苯酚濃度在1 000mg/L時,細菌生長受到嚴重的抑制而停滯,48 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)苯酚被降解。

圖5 CN-6菌株對300ppm苯酚的降解

2.3 pH

為了掌握pH對菌株降解苯酚的影響,實驗將CN-6菌株分別接種于苯酚質(zhì)量濃度為300mg/L、pH 值為4.5～9.5的mS培養(yǎng)液中,在30℃、120 rpm下水浴搖床培養(yǎng),持續(xù)無菌取樣測定苯酚濃度,所得結(jié)果見表1。

從表中可知,當(dāng)PH值低于6.0或高于8.5時,菌株對苯酚的降解速率快速下降;當(dāng)pH值在7.0～8.5時,菌株均能夠快速的降解苯酚。由實驗得到的最適降解pH值為8.5,說明堿性環(huán)境更利于CN-6的生長,這是由于苯酚在水溶液中為酸性(pH=5.2),根據(jù)唐偉等研究[12-13],苯酚對微生物的毒性隨pH值的增高而減小,因此堿性環(huán)境降低了苯酚毒性從而加快了微生物新陳代謝。

表1 PH對CN-6菌株降解苯酚的影響

試驗中MS培養(yǎng)液在30oC時初始生物量0.05～0.08;在PH4.5,5.0,9.5未觀測到苯酚的降解。

2.4 溫度

圖6 溫度對CN-6菌株降解苯酚的影響

2.5 溶氧量

水中的溶解氧含量對CN-6降解苯酚速率的影響通過比較細菌在水浴搖床不同晃動速率下對300mg/L的苯酚的降解時間得到。當(dāng)晃動速率從40 rpm增加到120 rpm,晃動速率與CN-6菌株的生物量(OD600)和對苯酚的降解速率正相關(guān),同時菌株可以穩(wěn)定持續(xù)的生長(圖7)。

圖7 晃動速度對CN-6菌株降解苯酚的影響

這是因為CN-6是兼性好氧菌,溶解氧作為一項重要的電子受體,在微生物的生長中發(fā)揮著重要的生理作用[14],搖床的晃動速率越快,質(zhì)傳效率就越高,使得培養(yǎng)基中的溶解氧含量增高。但是,當(dāng)晃動速率持續(xù)增加,細胞濃度和降解速率則維持相對的穩(wěn)定。因此,120 rpm是細菌生長和降解苯酚的最適條件。

2.6 細胞生長動力學(xué)

根據(jù)上述試驗發(fā)現(xiàn),菌株CN-6對苯酚的降解能力較高,隨苯酚初始濃度的增加,苯酚的降解速率提高,但在實驗中同時也發(fā)現(xiàn)高濃度的苯酚對降解產(chǎn)生了抑制作用。因此,在建立動力學(xué)模型時,需要選擇底物抑制模型。已經(jīng)有多種底物抑制模型被建立[15-17],其中Haldane'smodel最為常見,用來描述細胞的比生長速率模式。Haldane'smodel的定義如1式[18]:

式中,比生長速率μ(1/h)和底物濃度S(mg/L)由實驗數(shù)據(jù)得知,而最大比生長速率μmax(1/h)、親和性常數(shù)kS(mg/L)、抑制常數(shù)kI(mg/L)則是未知的動力參數(shù)。其中,μmax被視為降解能力的指標,數(shù)值愈大,代表降解速度愈快;KS值與菌種對底物的化學(xué)親和力成反比,數(shù)值愈大,代表菌種與底物親和力愈差;kI為抑制常數(shù),數(shù)值愈大,代表菌種對基質(zhì)耐受力愈好。由于Haldane'smodel為非線性的方程式,難以直接利用數(shù)值技術(shù)軟件估算其動力學(xué)參數(shù),故將原式整理為2式所示:

將實驗數(shù)據(jù)代入整理后的Haldane'smodel,利用MATLAB 7.0進行非線性回歸計算,如圖8所示。

圖8 比生長速率的動力學(xué)擬合

得到模型參數(shù)μmax=0.452 h-1;kS=28.617mg/L;kI=782.4mg/L。曲線擬合的最小標準平方差R2值為0.94。

從獲得的模型參數(shù)值可知,CN-6菌株的μmax、KS值較大,因此菌株對苯酚的降解速率較快,但對苯酚的耐受性有待提高,蔡尚原等[19-20]利用水楊酸預(yù)培養(yǎng)來活化細胞,大幅降低了細胞受酚抑制的影響,使細胞大幅提升對酚基質(zhì)的抗性,可以獲得更高的抑制常數(shù)kI。

4 結(jié)論

1)從長期受苯酚污染的土壤中經(jīng)富集培養(yǎng),篩選分離到1株革蘭氏染色陰性的細菌CN-6,經(jīng)形態(tài)觀察、16S rDNA序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析初步鑒定為Pseudomonas sp.。

2)CN-6能以苯酚為唯一碳源和能源生長,降解效率高,500mg/L的苯酚經(jīng)過17 h培養(yǎng)可完全降解,在 300mg/L時,平均小時苯酚降解量達到36.57mg/L。

3)CN-6生長和降解苯酚的pH、溫度和溶氧量范圍較廣,最適 PH、溫度分別為8.5和30℃;最適水浴搖床晃動速率為120 rpm。

4)由于高濃度苯酚時CN-6菌株的降解過程存在底物抑制現(xiàn)象,采用Haldane非競爭性底物抑制動力學(xué)模型,計算確定了模型參數(shù) μmax、kS和kI分別為 0.452 h-1、28.617mg/L 、782.4mg/L,模型擬合度高,為后續(xù)生物反應(yīng)器的設(shè)計和模擬提供了實驗依據(jù)。

致謝:感謝重慶大學(xué)國際事務(wù)處提供的赴臺研究便利。同時感謝臺灣元智大學(xué)生物科技與工程研究所簡志青教授、魏毓宏教授對該研究提出的寶貴意見和指導(dǎo)。

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