PCR法鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群亞種的研究

汪小黎 崔振玲 王潔 陸俊梅 胡忠義

(1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院 蘇州 215123;2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院上海市結(jié)核病(肺)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200433)

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中各菌型致病性和藥物敏感性不盡相同,在臨床治療前需要進(jìn)行菌種鑒定,目前臨床使用的生化方法耗時(shí)長(zhǎng),給治療帶來(lái)不便,本研究采用PCR法可快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群亞種,具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 人結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv,CMCC(B)95053)和牛結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(CMCC(B)93006),非洲分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(M.africanum,CMCC(B)95049)購(gòu)自國(guó)家菌種保存中心。19株牛結(jié)核分枝桿菌分離株(M.bovis),PNB培養(yǎng)生長(zhǎng)試驗(yàn)陰性,TCH培養(yǎng)生長(zhǎng)試驗(yàn)為陰性;20株人結(jié)核分枝桿菌分離株(M.tb),PNB培養(yǎng)生長(zhǎng)試驗(yàn)陰性,TCH培養(yǎng)生長(zhǎng)試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.1.2 試劑 羅氏培養(yǎng)基,參照文獻(xiàn)[1]制作;液體培養(yǎng)基為米氏7H9培養(yǎng)基(含10%OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑),購(gòu)自Difco公司;硝基苯甲酸(PNB)、2-羧酸肼噻吩(TCH)購(gòu)自sigma公司;基因組抽提裂解液為優(yōu)化堿裂解法配方,是本實(shí)驗(yàn)室自制;引物及探針合成由上海生物工程公司完成;PCR所有試劑購(gòu)自TAKARA公司;硝酸纖維薄膜,購(gòu)自Amersharn公司;其他試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR鑒定法 參照文獻(xiàn)[2]針對(duì)16S rRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、 Rv1970、Rv3877/8、Rv3120設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在此基礎(chǔ)上,針對(duì)M.bovis RD4區(qū)缺失的特點(diǎn),在缺失片段兩端設(shè)計(jì)一對(duì)新引物RD4-sense：5′-cccgcactgaccatgccattt-3′,RD4-antisense：5′-cgcaaggacctgttcaccaa-3′,M.bovis擴(kuò)增后的目的條帶為881 bp,M.tb擴(kuò)增后的目的條帶為2801 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 生物化學(xué)方法

1.2.2.1 PNB和TCH試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[1]操作。

1.2.2.2 TCH的MIC值測(cè)定 用液體培養(yǎng)基將TCH倍比稀釋至0.0625μg/ml,0.125μg/ml,0.25μg/ml,0.5μg/ml,1.0μg/ml。MIC 檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.2.3 硝酸還原酶實(shí)驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)[1]操作。

1.2.3 Spoligotyping檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[4]操作。

2 結(jié)果

2.1 PCR法鑒定結(jié)果

2.1.1 7對(duì)引物鑒定結(jié)果 39株臨床分離菌株電泳結(jié)果一致(圖1d)。

2.1.2 優(yōu)化PCR鑒定結(jié)果 8對(duì)引物PCR聯(lián)合鑒定,39株臨床分離菌株電泳結(jié)果一致(圖2d)。

2.2 生化鑒定結(jié)果 生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 TCH的MIC檢測(cè)結(jié)果 牛結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株MIC值為0.5μg/ml,5株TCH選擇培養(yǎng)基陰性臨床分離株和H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株的MIC值均≥1.0μg/ml。

圖1 PCR鑒定結(jié)果圖

圖2 優(yōu)化PCR鑒定結(jié)果圖

表1 39株臨床分離株及牛結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株,H37Rv生化鑒定結(jié)果a

表2 Spoligotyping檢測(cè)結(jié)果

2.4 Spoligotyping檢測(cè)結(jié)果 39株臨床分離株及H37Rv,牛結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株,非洲分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株Spoligotyping檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

目前臨床常用生化方法鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的方法存在時(shí)間長(zhǎng),無(wú)法準(zhǔn)確鑒定的缺點(diǎn),本研究用生化方法檢測(cè)結(jié)果顯示重復(fù)性差。為此本研究在已有PCR鑒定基礎(chǔ)上,進(jìn)一步改良優(yōu)化,建立了新的PCR鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群亞種的方法。

7對(duì)引物PCR鑒定結(jié)果分析顯示39株待檢菌株均非M.bovis,與M.tb標(biāo)準(zhǔn)株結(jié)果一致。M.tb和M.bovis是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中臨床最常見(jiàn)的2種,且根據(jù)已有報(bào)道[5]推測(cè)臨床標(biāo)本中不排除2種菌株同時(shí)存在的可能,但7對(duì)引物聯(lián)合鑒定法中由于牛結(jié)核分枝桿菌無(wú)特異特征條帶,無(wú)法檢測(cè)出混合菌株中的牛結(jié)核菌株。針對(duì)此缺陷,本研究根據(jù)M.bovis缺失RD4片段的特點(diǎn),在RD4片段兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目前Spoligotyping技術(shù)已大量應(yīng)用到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群亞種鑒定[6-8],本研究Spoligotyping檢測(cè)結(jié)果顯示39株待檢菌株均非M.bovis,與上述PCR擴(kuò)增鑒定法結(jié)果一致,顯示可有效鑒定人?；旌暇?。

我國(guó)臨床分離的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群主要為M.tb和M.bovis,本研究結(jié)果顯示優(yōu)化后的PCR法可有效鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群亞種,且與常規(guī)生化鑒定方法相比準(zhǔn)確性較高,操作簡(jiǎn)便快捷,具有較好的應(yīng)用前景。

[1]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國(guó)教育文化出版社,2006：54,56-57.

[2]Huard RC,Lazzarini LC,Butler WR,van Soolingen D,Ho JL.PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions[J].J Clin Microbio,2003,41(4)：1637-1650.

[3]Martin A,Morcillo N,Lemus D,M ontoro E,T elles MA,Simboli N,Pontino M,Porras T,León C,Velasco M,Chacon L,Barrera L,Ritacco V,Po rtaels F,Palomino JC.Multicenter study of MT T and resazurin assays for testing susceptibility to first-line anti-tuberculosis drug s[J].Int J Tuberc Lung Dis,2005,9(8)：901-6.

[4]Kamerbeek J,Schouls L,Kolk A,van Agterveld M,van Soolingen D,Kuijper S,Bunschoten A,Molhuizen H,Shaw R,Goyal M,van Embden J.Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology[J].J Clin Microbiol,1997,35(4)：907-914.

[5]李洪敏,吳雪瓊,張俊仙,王巍,程紅群.應(yīng)用PCR-SSCP快速鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群[J].微生物學(xué)通報(bào),2000,27(3)：202-204.

[6]Driscoll JR.Spoligotyping for molecular epidemiology of the Mycobacterium tuberculosis complex[J].Methods Mol Biol,2009,551：117-128.

[7]Duarte EL,Domingos M,Amado A,Botelho A.Spoligotype diversity of Mycobacterium bovis and Mycobacterium caprae animal isolates[J].Vet Microbiol,2008,130(3-4)：415-421.

[8]Vitol I,Driscoll J,K reiswirth B,Kurepina N,Bennett KP.Identifying Mycobacterium tuberculosis complex strain families using spoligotypes[J].Infect Genet Evol,2006,6(6)：491-504.