發(fā)光二極管熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)室診斷效果評(píng)價(jià)

尚美 劉冠 趙立平 夏輝 姜廣路 黃海榮 趙雁林

(北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所 北京 101149)

中國(guó)是僅次于印度的全球第2大結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家,我國(guó)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷水平與發(fā)達(dá)國(guó)家相比還有一定差距。目前,結(jié)核病的確診還依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷,已經(jīng)應(yīng)用了百余年的萋尼(Ziehl-Neelsen,ZN)染色技術(shù),以其簡(jiǎn)便、低廉、可靠,并能夠檢測(cè)出排菌病人,成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的主要技術(shù),直到現(xiàn)在仍廣泛應(yīng)用于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室。雖然此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)建立了完善的質(zhì)量控制體系,但是有研究表明,痰涂片檢測(cè)肺結(jié)核的敏感率為 20%～80%[1-3]。而利用金銨O(或者羅丹明)的熒光染色技術(shù)(fluorescence microscopy,FM)在普通熒光顯微鏡下讀片,則可以在低倍物鏡下觀察到分枝桿菌,縮短了技術(shù)員觀察同樣多視野所用的時(shí)間,適合應(yīng)用在工作量大的實(shí)驗(yàn)室,但其昂貴的價(jià)格及維和費(fèi)等原因阻礙了其在基層應(yīng)用。

近年來(lái),研究者們將發(fā)光二極管燈泡與熒光顯微鏡技術(shù)結(jié)合,研發(fā)了發(fā)光二極管熒光顯微鏡(light emitting diodes,LED)。LED發(fā)光譜較普通熒光顯微鏡窄,鏡下雜光較少,有相關(guān)研究也顯示其良好的應(yīng)用性[4-5]。為評(píng)價(jià) LED顯微鏡在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室的診斷效果,我們開(kāi)展了此研究。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材 研究中所用的光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯;熒光顯微鏡為奧林巴斯BH2-RFL-T3,所用物鏡為20×;發(fā)光二極管熒光顯微鏡為萊卡DM1000,所用物鏡為20×。

1.2 研究對(duì)象 本研究樣本為2008年5月—2009年1月間在北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所就診的初診病人的痰標(biāo)本,共409份。

1.3 研究設(shè)計(jì) 收集的標(biāo)本統(tǒng)一進(jìn)行金銨O染色,玻片鏡檢;重新編號(hào)涂片,5 d內(nèi)由相同技術(shù)員進(jìn)行LED熒光讀片;之后再重新編號(hào),經(jīng)萋尼染色后進(jìn)行ZN讀片。計(jì)算讀片所用時(shí)間,并計(jì)算所觀察的視野數(shù)。同一份標(biāo)本在制備涂片結(jié)束后進(jìn)行羅氏培養(yǎng)接種,8周后判讀結(jié)果。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 涂片染色及鏡檢 熒光染色讀片：0.1%的金銨O-石碳酸覆蓋涂片染色至少15 min,5%的鹽酸乙醇脫色3 min,0.5%的高錳酸鉀復(fù)染1 min,FM及LED法20×物鏡讀片。

萋尼染色讀片：用5%的鹽酸乙醇對(duì)染色好的熒光涂片脫色至無(wú)色為止,0.8%石碳酸復(fù)紅熱染,至出現(xiàn)蒸汽后保持染色5 min,5%的鹽酸乙醇脫色1 min,0.06%亞甲藍(lán)復(fù)染30 s。10×目鏡及40×物鏡調(diào)節(jié)焦距,100×油鏡讀片。

萋-尼染色、玻片鏡檢,熒光染色、玻片鏡檢的詳細(xì)操作步驟均按照《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]進(jìn)行。

1.4.2 羅氏培養(yǎng) 用LJ商品粉末(BD2444151)制備中性羅氏培養(yǎng)基,制備好的培養(yǎng)基進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。采用NaOH-NALC法對(duì)涂片后剩余的標(biāo)本進(jìn)行前處理,接種到羅氏培養(yǎng)基斜面上,37℃孵育,每周報(bào)告結(jié)果并及時(shí)報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果,于8周確定陰性結(jié)果。羅氏培養(yǎng)的詳細(xì)操作方法按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[7]進(jìn)行。

1.5 資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

在受試的409份痰標(biāo)本中,經(jīng)過(guò)8周培養(yǎng),有175份為陽(yáng)性,其中112份ZN涂片陽(yáng)性,121份FM涂片陽(yáng)性,130份LED陽(yáng)性。234份培養(yǎng)陰性標(biāo)本中,233份ZN涂片陰性,227份FM涂片陰性,227份 LED陰性(表1)。

表1 不同檢測(cè)方法的結(jié)果

以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn),用SPSS軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到各個(gè)方法的敏感性,特異性,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值,陰性預(yù)測(cè)值,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同檢測(cè)方法的敏感性和特異性

在所有涂片中,139張涂片為至少1種方法結(jié)果陽(yáng)性,其中137張為L(zhǎng)ED陽(yáng)性,128張為FM陽(yáng)性。LED及FM有13張結(jié)果不一致：11張LED陽(yáng)性FM陰性,而這11份標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性,1張為FM陽(yáng)性LED陰性,而培養(yǎng)為陽(yáng)性,另一張F(tuán)M陽(yáng)性LED陰性,培養(yǎng)為陰性(表3)。

表3 LED與FM檢測(cè)結(jié)果差異情況

表4 LED與ZN檢測(cè)結(jié)果差異情況

在139張陽(yáng)性涂片中,113張為ZN陽(yáng)性,26張結(jié)果與LED不一致：包括19張ZN陰性LED陽(yáng)性,培養(yǎng)結(jié)果為陽(yáng)性;6張ZN陰性 LED陽(yáng)性,培養(yǎng)結(jié)果為陰性;1張ZN陽(yáng)性 LED陰性,培養(yǎng)為陽(yáng)性(表 4)。

3種方法讀片所用讀片時(shí)間及報(bào)告陽(yáng)性結(jié)果所用平均視野的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 三種方法檢測(cè)所用時(shí)間及視野的差異

方差分析及q檢驗(yàn)結(jié)果表明,在檢測(cè)陽(yáng)性片、陰性片所用時(shí)間上,LED及ZN的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=231.7,P＜0.05);報(bào)告陽(yáng)性平均所用視野上LED及ZN的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=296.8,P＜0.05),而 LED及FM 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.9,P=0.91)。

3 討論

在我國(guó),作為診斷結(jié)核主力軍的縣級(jí)基層實(shí)驗(yàn)室,大多仍在使用應(yīng)用了125年的ZN技術(shù)。古老的ZN方法快速,過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單,但其敏感性不高。1937年Hagemann首次描述金銨O染色法,之后熒光染色技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用在痰涂片檢測(cè)上[8]。熒光染色最大的優(yōu)勢(shì)是可以用低倍的物鏡(通常20×)觀察,與普通光學(xué)的(通常100×觀察)相比,大大縮短了技術(shù)員觀察同樣多視野所用的時(shí)間[9],其染色方法也較萋尼法簡(jiǎn)單,從而減輕了工作負(fù)擔(dān)。

LED熒光顯微鏡所涉及的染色、讀片過(guò)程與普通熒光相同,但是其發(fā)射波譜范圍為440～460 nm,波寬為25 nm,金銨O在432 nm的吸收峰覆蓋了LED發(fā)出的其他光譜,因此其在鏡下的光柔和,對(duì)人親近性好,有關(guān)研究顯示其較FM有優(yōu)勢(shì)。

我們對(duì)409份初診病人痰標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn),相比于ZN及FM方法,LED方法有更高的敏感性,分別高5和10個(gè)百分點(diǎn),這與Steigner等[10]分析得到的結(jié)果一致;與2種方法相比,LED敏感性的增加表現(xiàn)在定性區(qū)別與定量區(qū)別上,LED與ZN的定性區(qū)別明顯多于 LED與FM,這說(shuō)明應(yīng)用在基層,LED可以提高病人發(fā)現(xiàn)率。而對(duì)于定量區(qū)別,LED與FM及LED與ZN都主要集中在陽(yáng)性級(jí)別高的涂片上,這與Steigner的結(jié)果不一致,可能是因?yàn)榧夹g(shù)人員對(duì)不同方法定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)不熟練。

在特異性上,LED與FM方法結(jié)果一致,比ZN方法低2個(gè)百分點(diǎn),有2個(gè)主要原因,首先是因?yàn)樵跓晒馊旧珬l件下,分枝桿菌與某些雜質(zhì)在鏡下都呈現(xiàn)為同樣的黃色桿狀或短棒狀,而不是萋尼染色條件下的紅色與藍(lán)色背景的明顯區(qū)分,這就需要很有讀片經(jīng)驗(yàn)的人來(lái)區(qū)分細(xì)菌與雜質(zhì),讀片的人對(duì)分枝桿菌的形態(tài)熟練掌握,包括未服藥及服藥后細(xì)菌形態(tài)的變化;另外與我們使用的 LED物鏡有關(guān)(20×),由于物鏡倍數(shù)較低及鏡下黑色的背景,技術(shù)人員難分辨鏡頭在玻片上的大概位置,未能完全辨別分枝桿菌與其他雜質(zhì)。本研究出現(xiàn)一張LED結(jié)果(陰性)與其他3種方法不一致,可能是個(gè)人誤差引起。鑒于熒光染色特異性低的不足,建議在將來(lái)應(yīng)用此方法檢測(cè)到1個(gè)“+”的涂片時(shí)脫色,用萋尼法涂片重新確認(rèn)抗酸菌。

根據(jù)《痰涂片的要求鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》的要求,用ZN方法看陰性片至少要5 min,讀夠300個(gè)油鏡視野,可是在實(shí)際工作中很難保證5min。在日常工作中,工作人員一般讀陰性片只用2 min,Cambanis等的一個(gè)實(shí)施性研究證明,用10 min的時(shí)間重新觀察陰性片,又提高50%的發(fā)現(xiàn)率,而10min在日常工作中是不能實(shí)現(xiàn)的[11]。Bennedsen等的研究表明,用FM 方法,平均1 min讀片得到的敏感率,已經(jīng)比4 min ZN方法讀片的敏感性高[12]。我們發(fā)現(xiàn)LED與FM方法在讀片所用的時(shí)間上及觀察的視野上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而LED無(wú)論是在讀片時(shí)間上及視野上,都較ZN法有很大優(yōu)勢(shì),尤其是在檢測(cè)陽(yáng)性片時(shí)間上。

在對(duì)周圍環(huán)境的要求上,LED沒(méi)有光線及暗室的要求,在一個(gè)光線微弱的環(huán)境中就可以讀片,而熒光顯微鏡則不同。在發(fā)生光源上,FM發(fā)出的黃色光刺眼,操作者容易產(chǎn)生視覺(jué)疲勞,這也可能是FM敏感性低的原因之一;而LED的藍(lán)光柔和,背景與目標(biāo)對(duì)比鮮明,不易產(chǎn)生視覺(jué)疲勞,使用者很容易接受;使用LED不用擔(dān)心汞蒸氣對(duì)身體的傷害;無(wú)需提前打開(kāi)光源預(yù)熱,并且在讀片的過(guò)程中顯微鏡沒(méi)有熱量產(chǎn)生。

在檢測(cè)費(fèi)用上,LED顯微鏡的價(jià)錢與普通光學(xué)顯微鏡相近,為FM的10%。FM使用的汞氣發(fā)生燈泡昂貴并且壽命短(200～300 h),需要定期檢測(cè)紫外光源的功率,因?yàn)楣β什蛔愫茈y在熒光條件下觀察到明顯的分枝桿菌還需要持續(xù)不斷的電源供應(yīng),因?yàn)椴粩嗟拈_(kāi)關(guān),會(huì)損害燈的壽命,在基層的很多實(shí)驗(yàn)室,很難保證穩(wěn)定的電源供應(yīng),基于以上原因,盡管ZN染色敏感性偏低,卻一直被廣泛使用。LED可以用電池及低電壓來(lái)代替電源操作,LED燈泡不需要定期維護(hù),壽命大約為50000 h,光的強(qiáng)度也容易調(diào)節(jié),甚至可以從光學(xué)轉(zhuǎn)為熒光。

目前,在全國(guó)結(jié)核病網(wǎng)絡(luò)中,萋尼染色試劑主要由省級(jí)統(tǒng)一采購(gòu)或配置,將來(lái)到LED顯微鏡推廣使用,其所用的金銨O試劑,可由省級(jí)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一配制并進(jìn)行質(zhì)量控制,因金銨O粉末存在潛在毒性,低級(jí)別實(shí)驗(yàn)室自行配制存在危險(xiǎn),另外金銨O粉末價(jià)格與石碳酸復(fù)紅的價(jià)格均較低,而商品化染色劑價(jià)格偏高。

鑒于LED顯微鏡簡(jiǎn)單,價(jià)格低廉,具有高敏感性和相似特異性的優(yōu)點(diǎn),另外,讀片所用的時(shí)間及視野都較ZN法有很大優(yōu)勢(shì),有可能作為常規(guī)光學(xué)顯微鏡的代替,尤其是在結(jié)核負(fù)擔(dān)嚴(yán)重而實(shí)驗(yàn)室條件薄弱的地區(qū)。

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