活性酶與多發性硬化

梁 活 綜述 曾 麗 審校

廣西醫科大學第一附屬醫院神經內科 南寧 530021

多發性硬化(multip le sclerosis,M S)被認為是中樞神經系統(CNS)慢性炎癥性脫髓鞘性自身免疫疾病,其病因及發病機制未明。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmune encephalom yelitis,EAE)是研究MS的動物模型。在MS發病過程中各種酶類表達活性增加,明確各種蛋白酶在MS中作用對制定治療策略有重要意義。本文就各種蛋白酶與MS/EAE的關系進行綜述。

1 基質金屬蛋白酶

以前認為,基質金屬蛋白酶(matrix metallop roteinases, MMPs)能降解細胞外基質(ECM)和髓磷脂,破壞血腦屏障,促進白細胞進入CNS,是MS的重要致病因素。但近來發現不同MMPs在MS/EAE中作用不同,并不完全扮演有害角色。

研究顯示,MM P-7、MMP-8、MMP-28參與MS/EAE致病。MMP-7基因敲除鼠抵抗EAE發生,另外,MMP-7能增加血腦屏障內皮細胞間通透性,使免疫細胞易于侵入CNS[1]。MMP-8基因敲除鼠EAE臨床癥狀顯著減輕,侵潤CNS炎癥細胞減少,脫髓鞘減輕[2]。在MS和EAE的脫髓鞘病灶中MMP-28表達增加,在鼠后根神經節細胞髓鞘生成培養中加入MMP-28會使髓鞘生成減少,用MMP-28抗體pAb180或 pAb183中和 MMP-28的活性,則增加髓鞘生成[3]。MMP-28使髓鞘生成減少的機制未明,認為可能與影響髓鞘生成的信號轉導有關。值得注意的是,MMP-12基因敲除鼠在緩解復發型EAE中復發時呈現更嚴重的癥狀,同時在EAE慢性期趨化因子(如MCP-1等)和炎癥因子(IFN-γ、IL-17、IL-6等)顯著增加[4]。另外,MM P-12基因敲除鼠表達T-bet增加,而表達GATA-3減少,T-bet被認為是Th1特征性轉錄因子,促進Th向Th1效應細胞分化[5]。MMP-2基因敲除鼠中MMP-9表達增多,EAE發病提早,加重EAE[6]。以上研究提示了針對MMPs抑制治療要謹慎把MMP-12、MMP-2作為抑制目標。

2 腎素和血管緊張素轉化酶

血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,ANGⅡ)是腎素-血管緊張素系統(RAS)中活性最強的物質,是血管緊張素原在腎素和血管緊張素轉化酶(ACE)作用下生成,ANG II與血管緊張素受體(angiotensin receptors)結合產生各種生物效應,特別對調節心血管系統有重要作用。最近研究顯示RAS參與MS/EAE發病,EAE血清中的腎素活性增加,且在EAE的脾及脊髓中腎素、ACE、血管緊張素Ⅱ受體(angiotensinⅡtype-1 receptor,AT1R)表達顯著增加,用AT1R拮抗劑氯沙坦(losartan)、ACE抑制劑依那普利(enalap ril)和腎素抑制劑阿利克侖(aliskiren)治療 EAE能顯著減輕 EAE臨床癥狀[7]。在慢性和急性EAE的脾及脊髓中,A T1R拮抗劑氯沙坦能顯著減少趨化因子 CCL2、CCL3和CXCL10的mRNA水平,減少巨噬細胞遷移[7]。在MS和EAE中T細胞和巨噬細胞表達AT1R。用ACE抑制劑賴諾普利(lisinop ril)和AT1R拮抗劑坎地沙坦(candesartan)能抑制 Th1和Th17分泌的促炎因子(如IL-17、IFN-γ),并上調抗炎因子(如IL-10),增加CNS中CD4+、FoxP3+、T細胞數量,能逆轉EAE癱瘓癥狀[8]。

以上研究表明,ACE、腎素抑制劑和AT1R拮抗劑能減少炎癥因子、趨化因子分泌和減少巨噬細胞等抗原提呈細胞遷移到CNS,使T細胞增殖、侵潤減少,并能增加T調節細胞,改善EAE病情。抑制RAS是治療MS潛在的新靶點。

3 鈣蛋白酶

鈣蛋白酶(calpain)是特異性依賴鈣激活的蛋白水解酶,在MS/EAE中鈣蛋白酶的活性增加,鈣蛋白酶與MS/EAE的脫髓鞘、軸索損害、神經元凋亡等病理變化密切相關。在急性EAE脊髓中鈣蛋白酶和半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)表達增多,活性上調,促進神經元凋亡[9]。抑制鈣蛋白酶使EAE發病延遲,癥狀減輕,病程縮短,且顯著減少軸突損傷標志物淀粉樣前蛋白(amy loid p recursor protein,APP)、NaV1.6通道,減輕軸突損傷[10-11]。過繼轉移經鈣蛋白酶抑制劑SJA6017孵育的髓鞘堿性蛋白特異性T細胞到SJL/J小鼠,能顯著減輕EAE癥狀及脫髓鞘、炎癥反應、軸索損害、少突膠質細胞和神經元的調亡、喪失[12],說明用鈣蛋白酶抑制劑抑制T細胞能減少T細胞致病性,改善EAE病情。

4 谷氨酸代謝酶

興奮性毒性是指過量興奮性氨基酸引起的神經毒性作用。MS活動病灶受損軸索的旁小膠質細胞和巨噬細胞高水平表達谷氨酰胺酶,且MS病灶中少突膠質細胞缺乏谷氨酸脫氫酶(glutam ine dehyd rogenase,GDH)和谷氨酰胺合成酶(glutam ine synthetase,GS)[13]。另外,MS活動性病灶中少突膠質細胞、星形膠質細胞的興奮性氨基酸轉運體(excitatory am ino acid transporter,EAAT)表達減少,谷氨酸重攝取減少[13-15]。谷氨酰胺酶使谷氨酸產生增多,缺乏GDH和GS使利用谷氨酸減少,谷氨酸累積于細胞外,過量的谷氨酸作用于神經組織谷氨酸受體(glutamate recep tors,G luR)產生興奮性毒性作用。

Vercellino等對MS大腦皮質[14]和深部灰質[15]的病灶研究時,發現在小膠質細胞大量激活的大腦皮質病灶內突觸囊泡蛋白喪失和神經元受損。在慢性進展MS深部灰質的活動性病灶,活化的小膠質細胞與神經元緊密接觸,有神經元喪失。在小膠質細胞活化的病灶中星形膠質細胞的EAAT-1、EAAT2表達減少。Vercellino等認為是因為谷氨酸重攝取異常引起谷氨酸累積于細胞外,興奮性毒性導致MS大腦皮質和深部灰質的病理改變。用谷氨酰胺酶抑制劑6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)減少活化的小膠質細胞產生谷氨酸,減輕EAE發病[16]。

5 線粒體呼吸鏈酶復合體

線粒體呼吸鏈酶復合體包括復合體(comp lex)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在MS病人的大腦皮層(特別是運動神經元),線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ和Ⅲ活性下降,導致ATP生成減少,能量不足引起Ca2+介導軸索變性,病人的神經功能進展性障礙[17]。

Mahad等[18]發現在MS慢性活動性病灶邊緣的脫髓鞘軸突內線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ活性下降,軸突內損傷標志物APP堆積,且復合體Ⅳ活性與小膠質細胞/巨噬細胞密度負相關。M ahad等認為是小膠質細胞/巨噬細胞介導的炎癥致復合體Ⅳ活性下降,引起能量不足,導致軸索損傷。因為小膠質細胞/巨噬細胞分泌的NO與活性氧反應,產生過氧亞硝酸鹽,可以通過硝化催化亞基、氧化損傷線粒體DNA不可逆地抑制復合體Ⅳ活性。

6 一氧化氮合酶和環氧化酶

在MS病灶中活化的小膠質細胞、星形膠質細胞和內皮細胞大量表達NOS[19]。NOS增多使生成NO增多,NO和超氧陰離子反應生成強氧化劑過氧亞硝酸鹽會損害組織。如使脫髓鞘、少突膠質細胞和神經元壞死或凋亡。運動神經元比少突膠質細胞更易受NO的毒性損傷[20]。軸索在NO存在下,更易發生變性和傳導障礙。在微克分子的NO濃度下,就可以使在生理頻率下傳導沖動的軸索發生沃勒變性,傳導阻滯[21]。

Rose等[22]發現,在 MS活動性脫髓鞘病灶中受損少突膠質細胞旁的小膠質細胞/巨噬細胞內常同時表達iNOS和環氧化酶-2(COX-2),認為激活的小膠質細胞/巨噬細胞能同時表達iNOS和COX-2,而且NO可以上調 COX-2活性, COX-2產生活性氧(reactive oxygen species,ROS)與NO生成過氧亞硝酸鹽使谷氨酸轉運體失活,谷氨酸重攝取障礙。COX-2產生前列腺素能促進細胞(如星形膠質細胞)釋放谷氨酸。提示了在MS中,iNOS和COX-2也可以使谷氨酸釋放增多,重攝取障礙,使谷氨酸在細胞外堆積產生興奮性毒性。

7 結語

以上研究表明,活性酶參與MS致病過程,且活性酶在MS中并不是彼此獨立,而是相互作用。如NOS使NO生成增多,NO與ROS反應產生的過氧亞硝酸鹽可抑制呼吸鏈酶復合體Ⅳ活性。谷氨酸代謝異常使谷氨酸堆積于細胞外,作用于神經元的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體引起大量Ca2+內流并在線粒體內堆積,可導致線粒體功能喪失,且NM DA受體激活也可以上調NOS活性。酶的相互作用使酶在MS中致病效應放大,更充分說明了針對活性酶治療MS的重要性。干擾素(Interferon,IFN)-β是治療MS的有效藥物,其機制之一就是抑制MMPs,用IFN-β治療MS可以有效地減少病人MMP-9表達[23]。相信隨著研究的深入,活性酶將成為治療MS有效靶點。

[1] Buhler LA,Samara R,Guzm an E,et al.Matrix m etalloproteinase-7 facilitates immune access to the CNS in experim ental autoimmune en cephalomyelitis[J].BMC Neu rosci,2009,10:17.

[2] Folgueras AR,Fueyo A,García-Suárez O,et al.Collagenase-2 deficiency or inhibition impairs ex perimental autoimmune encephalomyelitis inm ice[J].JBiolChem,2008,283(14):9 465-9 474.

[3] W erner SR,Dotzlaf JE,Sm ith RC.MMP-28 as a regulator of myelination[J].BMC Neurosci,2008,9:83.

[4] Goncalves DaSilva A,Yong VW.Matrix metalloproteinase-12 deficiency w orsens relapsing-rem itting experimental au toimmune encephalomyelitis in association w ith cytokine and chemokine dysregulation[J].Am J Pathol,2009,174(3):898-909.

[5] W eaver A,Goncalves daSilva A,Nu ttall RK,et al.An elevated m atrix metalloproteinase(MMP)in an animalmodel of multiple sclerosis is protective by affecting Th1/Th2 polarization [J].FASEB J,2005,19(12):1 668-1 670.

[6] Esparza J,K ruse M,Lee J,et al.MM P-2 nullm ice exhibit an early onset and severe experimental autoimmune en cephalomyelitis due to an increase in MM P-9 exp ression and activity[J]. FASEB J,2004,18(14):1 682-1 691.

[7] Stegbauer J,Lee DH,Seubert S,et al.Role of the renin-angiotensin system in autoimmune inflammation of the central nervous system[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(35):14 942-14 947.

[8] Platten M,Youssef S,Hu r EM,et al.Blocking angiotensin-converting enzyme induces potent regu latory T cellsandmodulates TH 1-and TH 17-mediated autoimmunity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(35):14 948-14 953.

[9] Das A,Guyton MK,Matzelle DD,et al.Tim e-dependen t increases in protease activities fo r neu ronal apoptosis in spinal cords of Lew is rats du ring development of acute experimental au toim-mune en cephalomyelitis[J].J Neurosci Res,2008,86(13):2 992-3 001.

[10] Hassen GW,Feliberti J,Kesner L,et al.A novel calpain inhibitor for the treatment of acute experimental au toimm une encephalomyelitis[J].J Neu roimm unol,2006,180(1/2):135-146.

[11] Hassen GW,Feliberti J,Kesner L,et al.Preven tion of axonal injury using calpain inhibitor in ch ronic p rog ressive experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].Brain Res,2008,1 236:206-215.

[12] Guy ton MK,Brahm achari S,Das A,et al.Inhibition of calpain attenuates encephalitogenicity of MBP-specific T cells[J].J Neu rochem,2009,110(6):1 895-1 907.

[13] W erner P,Pitt D,Raine CS.Mu ltiple sclerosis:altered glutamate homeostasis in lesions correlates w ith oligodendrocyte and axonal damage[J].Ann Neu rol,2001,50(2):169-180.

[14] Vercellino M,Merola A,Piacentino C,et al.A ltered glutamate reuptake in relapsing-rem itting and secondary progressivem ultiple sclerosis cortex:co rrelation w ith m icroglia in filtration,demyelination,and neu ronal and synaptic damage[J]. JNeuropathol Exp Neurol,2007,66(8):732-739.

[15] Vercellino M,Masera S,Lorenzatti M,et al.Demyelination, inflammation,and neurodegeneration in multiplesclerosis deep g raymatter[J].JNeuropathol Exp Neurol,2009,68(5):489-502.

[16] Shijie J,Takeuchi H,Yaw ata I,et al.Blockade of glutam ate release from m icroglia attenuates experimental au toimm une encephalomyelitis in m ice[J].Tohoku J Exp Med,2009,217 (2):87-92.

[17] Dutta R,M cDonough J,Yin X,et al.M itochondrial dysfunction asa cause of axonal degeneration inmultip le sclerosis patients[J].Ann Neu rol,2006,59(3):478-489.

[18] M ahad DJ,Ziab reva I,Campbell G,et al.M itochondrial changes within axons in multiple sc lerosis[J].Brain,2009,132(Pt 5):1 161-1 174.

[19] Broholm H,Andersen B,Wanscher B,et al.Nitric oxide synthase exp ression and enzymatic activity in multiple sclerosis [J].Acta Neu rol Scand,2004,109(4):261-269.

[20] Bishop A,H obbs KG,Egu chi A,et al.Differential sensitivity of oligodend rocy tes and motor neurons to reactive nitrogen species:im plications for multiple sclerosis[J].JNeu rochem, 2009,109(1):93-104.

[21] Sm ith KJ,Kapoor R,Hall SM,et al.Electrically active axons degenerate w hen exposed to nitric oxide[J].Ann Neu rol, 2001,49(4):470-476.

[22] Rose JW,Hill KE,W att HE,et al.Inflammatory cell ex pression of cy clooxygenase-2 in themu ltiple sclerosis lesion[J].J Neuroimmunol,2004,149(1/2):40-49.

[23] Bernal F,Elias B,Hartung HP,et al.Regulation of matrix m etalloproteinases and their inhibitors by interferon-β:a longitudinal study in multiple sclerosis patients[J].Mu lt Scler, 2009,15(6):721-727.