集落刺激因子對慢性腦缺血成年鼠膠質細胞可塑性及記憶改善的影響

舒細記 柳威 周紅艷 熊巍鵬 陳艷華 艾永循

有關慢性腦缺血損傷后認知障礙的康復治療一直是臨床熱點，以往多關注神經細胞的修復對認知預后的影響。目前研究發現，膠質細胞的修復對認知功能改善的作用同樣至關重要，膠質細胞可以通過改變自身特性以適應內外環境的損傷刺激而具有可塑性，包括細胞數量的增加，細胞胞體突起長度上的變化，非星狀及放射狀細胞向星形膠質細胞的形態轉化等，其中以細胞胞體突起長度變化最為明顯［1］。膠質細胞可塑性在神經信息傳遞、整合和調控等促進認知改善的過程中起關鍵作用［2］。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)對于造血細胞的生長和分化起重要介導作用，具有刺激骨髓干細胞遷移、增殖、分化、成熟等生物學功能。本研究構建慢性腦缺血模型，從膠質細胞可塑性改變及學習記憶功能改善的角度，探討rhG-CSF對慢性腦缺血損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 建模與分組 3月齡雄性清潔級SD大鼠45只，體重(287±37)g，隨機分為缺血組、對照組和干預組，每組15只。1%戊巴比妥鈉35～40 mg/kg麻醉大鼠，分離并結扎雙側頸總動脈，作為缺血組。假缺血的對照組僅分離雙側頸總動脈但不結扎。大鼠術后再常規飼養6個月，期間有8只死亡，最后存活鼠缺血組11只、對照組14只、干預組12只。干預組rhG-CSF(齊魯制藥公司產品)的劑量為10 μg/kg;缺血組、對照組采用生理鹽水作為安慰劑，均皮下注射，手術6個月后連續3 d，停藥5 d，完成學習記憶功能評估后立即處死大鼠，取材制片。

1.2 學習記憶功能評估 通過定位航行實驗評估大鼠空間學習能力，空間探索實驗評估大鼠空間記憶能力。評估實驗前1 d，讓大鼠在無逃逸平臺的水池中適應性游泳2 min。定位航行實驗：連續5 d，每天上午同一操作者將大鼠面向池壁從不同象限入水，找到平臺后站立15 s，記錄其找到隱匿平臺所耗的逃逸時間，再從平臺上移開休息60 s后進行下一輪實驗。若在120 s內大鼠未找到平臺，由操作者引導上平臺，逃逸時間記為120 s。空間探索實驗：完成定位航行實驗后撤去平臺，將大鼠從平臺所在的對面象限中放入水池，記錄2 min內大鼠穿過平臺所在區域的次數及停留于平臺所在象限的時間。

1.3 海馬膠質細胞可塑性的圖像分析 4%多聚甲醛全身灌注固定，取含海馬結構的組織制片。免疫組化染色采用即用型GFAP抗體及PV-9000試劑盒完成。設PBS為一抗陰性對照、已知陽性切片為陽性對照，GFAP以細胞質出現棕色顆粒為陽性。采用MOTIC Med 6.0分析系統進行圖像分析。在海馬CA1區隨機選定起始區后連續采集5個“400?”視野，以“個/視野”為單位記錄GFAP陽性細胞數。同時，每個高倍視野隨機選取10個形態明確胞質突起完整的GFAP陽性細胞，記錄每個待測細胞最長胞質突起的長度(μm)。

2 結果

2.1 rhG-CSF對空間學習記憶能力的影響 定位航行實驗中，隨著訓練天數的增加，各組大鼠找到隱匿平臺的逃逸潛時間逐漸減少(表1)。缺血組的整體逃逸時間明顯多于對照組(P＜0.01)，干預組逃逸時間明顯少于缺血組(P＜0.01)。空間探索實驗中，缺血組大鼠停留于平臺所在象限的時間(12.16±4.33)較對照組(19.32±5.41)明顯減少(P＜0.05)，缺血組大鼠穿過平臺的次數(4.36±1.95)較對照組(11.08±3.74)明顯減少(P＜0.01)。干預組大鼠停留于平臺所在象限的時間(15.76±4.53)明顯高于缺血組(P＜0.05)，干預組大鼠穿過平臺的次數(8.47±2.71)明顯多于缺血組(P＜0.05)。

2.2 海馬CA1區的膠質細胞可塑性觀察 就膠質細胞數量變化而言，缺血組(28.67±5.97)海馬CA1區GFAP陽性細胞數目較對照組(59.48±8.63)明顯減少(P＜0.01)，干預組海馬CA1區GFAP陽性細胞(39.25±4.83)較缺血組明顯增多(P＜0.05)。就膠質細胞胞質突起變化而言，缺血組海馬CA1區GFAP陽性細胞胞質突起的平均長度(167.57±35.74 μm)較對照組(256.74±45.27 μm)明顯縮短(P ＜0.05)，干預組GFAP陽性細胞的胞質突起平均長度(196.43±26.83 μm)較缺血組明顯延長(P＜0.05)。

2.3 大鼠空間記憶能力與膠質細胞可塑性的相關性分析 各組大鼠海馬CA1區GFAP陽性細胞胞質突起長度的變化與對應的平臺所在象限停留時間(r=0.615，F=0.613，P＜0.05)、穿過平臺區域次數的變化趨勢(r=0.601，F=0.637，P＜0.05)均呈正相關;各組海馬CA1區GFAP陽性細胞數量的變化與對應的平臺所在象限停留時間(r=0.681，F=6.409，P＜0.05)、穿過平臺區域次數的變化趨勢(r=0.749，F=9.512，P ＜0.05)呈正相關。

3 討論

慢性腦缺血是血管性癡呆、Alzheimer、Binswanger等多種慢性腦血管病的共同病理過程，可致器質性中樞神經損傷和功能性認知障礙。rhG-CSF作為一種多潛能的造血生長因子，可動員外周血骨髓干細胞向中樞系統遷移，分化為神經元和膠質細胞，修復中樞系統損傷。海馬是腦缺血損傷最敏感的區域之一，與學習記憶等認知功能密切相關。本研究著重探討rhG-CSF對慢性腦缺血后海馬膠質細胞可塑性及記憶功能的影響。

星形膠質細胞為最主要的膠質細胞，GFAP是星形膠質細胞的特異性分子標記物。本研究通過病理組織學觀察分析星形膠質細胞可塑性發現，對照組GFAP陽性細胞數量最多、胞質突起長度最長，干預組次之，缺血組GFAP陽性細胞數量最少、胞質突起分支少而短小，部分GFAP陽性細胞胞質突起崩解。通過定位航行實驗發現，干預組大鼠逃逸時間顯著低于缺血組，提示rhG-CSF干預后慢性腦缺血大鼠學習障礙明顯改善。空間探索實驗發現，干預組大鼠平臺所在象限的停留時間及跨越平臺次數均顯著高于缺血組，提示rhG-CSF治療后大鼠記憶障礙明顯改善。由此證實，rhG-CSF可有效改善慢性腦缺血大鼠的認知障礙。對照組與缺血組、干預組與缺血組的GFAP陽性細胞數量及胞質突起長度的組間分析，均有統計學差異，前者提示慢性腦缺血對星形膠質細胞的損傷，后者提示rhG-CSF可有效促進缺血海馬的星形膠質細胞可塑性變化。

本研究對膠質細胞可塑性與認知記憶改善趨勢的進一步相關性分析發現，各組GFAP陽性細胞的數量及其胞質突起長度變化，與大鼠停留于平臺所在象限的時間、穿過平臺區域次數均呈正相關，提示rhG-CSF可通過激活星形膠質細胞數量增生、胞質突起長度延長等可塑性變化，來促進大鼠空間記憶能力的改善。新生星形膠質細胞可為神經細胞遷移提供腳手架，神經細胞軸突生長沿星形膠質細胞突起形成的架橋爬行遷移，形成有效的軸突通路。同時，新生星形膠質細胞可釋放出興奮性氨基酸、前列腺素等神經活性物質，調控神經元的功能［3］，促進神經元間突觸網路的建立，增加傳導速度［4］。星形膠質細胞還在突觸發生、突觸傳遞的調節中發揮重要功能［5］，是神經信息傳遞、整合和調控過程中的關鍵角色［2］，rhG-CSF干預后的膠質細胞可塑性變化，可能是學習記憶損害后功能改善的重要病理修復機制之一。但rhG-CSF通過誘導膠質細胞可塑性變化來改善認知障礙的神經信號傳導機制，還有待進一步深入研究。

［1］商永華，王群，陸兵勛，等.慢性腦缺血大鼠學習記憶變化及甲狀腺激素的影響.中國康復醫學雜志，2007，22(3)：209-211.

［2］Halassa MM，Haydon PG.Integrated brain circuits：astrocytic networks modulate neuronal activity and behavior.Annu Rev Physiol，2010，172：335-355.

［3］Tsuda M，Shigemoto-Mogami Y，Koizumi S，et al.P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia after nerve injury.Nature，2003，424(6950)：778-783.

［4］Ullian EM，Sapperstein SK，Christopherson KS，et al.Control of synapse number by glia.Science，2001，291(5504)：657-661.

［5］Eulenburg V，Gomeza J.Neurotransmitter transporters expressed in glial cells as regulators of synapse function.Brain Res Rev，2010，63(1-2)：103-1012.