原花青素對大鼠腦缺血再灌注損傷代謝障礙的影響

陳香紅 張 艷

1)鄭州市第一人民醫院 鄭州 450004 2)鄭州大學基礎醫學院藥理學教研室 鄭州 450052

在腦缺血再灌注損傷過程中,腦組織常常伴有代謝障礙,如乳酸含量的增加,能量代謝酶活性的降低,腦細胞水腫等的發生。以上改變最終會導致神經功能障礙、神經元損傷及壞死。原花青素(PC)是一種來源于植物的天然多酚類化合物,具有廣泛的藥理活性,近年研究表明,它可通過抗凋亡、抗氧化、清除自由基在局灶性腦缺血損傷中發揮腦保護作用[1-4],本文主要探討原花青素對大鼠局灶性腦缺血再灌注代謝障礙的影響,從而進一步研究其腦保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 原花青素(安陽晶森天然產物有限公司,批號:07031802);乳酸檢測試劑盒和ATP酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20070925)

1.2 主要儀器 722紫外分光光度計,電動玻璃勻漿機,手術器械等。

1.3 實驗動物及分組 實驗采用健康成年雄性SD大鼠,體質量250～280 g,購自河南省實驗動物中心。實驗前室溫下(20～25℃)保持明/暗交替各12 h,環境適應性喂養1周,給予普通飼料和自由飲水。將80只SD大鼠隨機分為5組,每組16只,即假手術組、模型組及 3個 PC劑量(50、100、200 mg/kg)組,模型組和各藥物組分別在大鼠腦缺血2 h后進行神經功能學評分,再灌注24 h后處死大鼠。

1.4 給藥方式 采用腹腔給藥的方式,各劑量藥物組分別于術前0.5 h注射不同濃度的原花青素溶液,腦缺血后2 h重復給藥1次。假手術組和模型組分別給予等量的生理鹽水。

1.5 模型制備 將市售尼龍魚線剪成約50 cm長的線段,用蚊香將線段一端頭部燙成光滑圓球(直徑約為5 mm),在距頭端 20 mm處用紅色記號筆作標記,然后將線段置于75%酒精中備用;用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)經腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,作頸部正中切口,分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)和翼腭動脈(PPA);結扎ECA主干和PPA,在CCA上近CCA和ICA的分叉處用眼科剪剪一小口,由此切口插入備用線段,經CCA進入ICA,繼續緩慢將魚線向ICA入顱方向推進,微遇阻力時停止進線,表明魚線頭端已經到達大腦中動脈(M CA)起始處,插入深度自頸總動脈分叉處至MCA起始處為17～19 mm,即完成了右側MCA的阻塞。缺血2 h后提拉線段,實現MCA的再灌注[5-7]。

1.6 神經功能評分 采用Longa[8]評分法對缺血2 h后清醒動物進行神經功能行為學評分。評分標準:0分:無明顯神經病學癥狀;1分:不能完全伸展左側前爪;2分:向左側旋轉;3分:行走時向左側傾倒;4分:不能自動行走,意識水平下降。對于評分≥2分且再灌注24 h后仍存活的大鼠篩選入組進行后續的實驗。

1.7 腦水腫的測定 在腦缺血再灌注后處死大鼠,取出右側大腦組織,用濾紙吸干表面水分,立即于電子天平稱重(濕質量),120℃恒溫烘烤24 h至恒重后再次稱重(干質量),采用干濕質量法測定腦組織含水量,按Ellis公式[9]計算腦組織含水量:腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.8 腦組織勻漿的制備 將大鼠按時斷頭,取右側腦組織,稱取腦組織塊約0.5 g,用預冷的生理鹽水沖洗組織表面的血液,濾紙吸干,再次稱重放于電動玻璃勻漿器中,按0.1 g∶0.9 mL加入預冷的生理鹽水制成腦組織勻漿,再以3 000～4 000 rpm的速度低溫離心10 min,取上清液,即為10%的腦組織勻漿,分裝,放-20℃冰箱保存備用。

1.9 乳酸含量及能量代謝酶活性的測定 取上述腦組織勻漿,應用722紫外分光光度計,按測試劑盒說明書測定乳酸含量、Na+-K+-ATP酶活性、Ca2+-ATP酶活性。考馬斯亮藍法測定蛋白的含量。

1.10 統計學處理 采用SPSS 11.0統計軟件分析處理數據。所得結果以均數±標準差(±s)表示。多組間計量資料比較采用單因素方差分析檢驗,2組間比較采用LSD檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 神經功能行為學評分 與假手術組相比,模型組神經功能行為學評分升高(P＜0.05);與模型組相比,PC中、高劑量組神經功能行為學評分降低(P＜0.05),而低PC劑量組神經功能行為學評分無顯著變化(P＞0.05);PC中、高劑量組神經功能行為學評分差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 腦組織含水量 與假手術組相比,模型組腦組織含水量升高(P＜0.05);與模型組相比,PC高、中劑量組腦組織含水量有所降低(P＜0.05),而低PC劑量組腦組織含水量無顯著變化(P＞0.05);PC中、高劑量組腦組織含水量差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 PC對大鼠腦缺血再灌注損傷神經功能評分及腦組織含水量的影響 (±s,n=8)

表1 PC對大鼠腦缺血再灌注損傷神經功能評分及腦組織含水量的影響 (±s,n=8)

注:與假手術組比較,*P＜0.05;與模型組比較,▲P＜0.05

組別 PC劑量(mg/kg) 神經功能評分 腦組織含水量(%)假手術組 0 0.80±0.34 76.30±0.21模型組 0 3.00±0.31* 80.65±0.19*PC低劑量組 50 2.80±0.33 80.37±0.34 PC中劑量組 100 2.00±0.30▲ 78.23±0.26▲PC高劑量組 200 1.80±0.29▲ 77.95±0.09▲

2.3 腦組織乳酸含量 模型組腦組織乳酸含量較假手術組升高(P＜0.05);PC低、中、高劑量組腦組織乳酸含量均較模型組降低(P＜0.05)。見表2。

2.4 能量代謝酶活性的改變 Na+-K+-ATPase活性:模型組Na+-K+-ATPase的活性較假手術組降低(P＜0.05);PC中、高劑量組較模型組升高(P＜0.05);PC中、高劑量組間無顯著差異(P＞0.05);PC低劑量組與模型組相比無顯著差異(P＞0.05)。Ca2+-ATPase活性:模型組 Ca2+-ATPase活性較假手術組降低(P＜0.05);PC高劑量組Ca2+-ATPase活性較模型組有所增高(P＜0.05)。見表2。

表2 PC對大鼠腦缺血再灌注時乳酸含量,Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase活性的影響 (±s,n=8)

表2 PC對大鼠腦缺血再灌注時乳酸含量,Na+-K+-ATPase,Ca2+-ATPase活性的影響 (±s,n=8)

注:與假手術組比較,*P＜0.05,與模型組比較,▲P＜0.05

組別 PC劑量(mg/kg)乳酸含量(mmol/gprot)Na+-K+-ATPase活性(μmolPi/mgprot?h)Ca2+-ATPase活性(μmolPi/mgprot?h)假手術組 0 9.78±1.38 6.89±0.74 4.10±1.06模型組 0 27.67±5.08* 3.24±1.03* 2.07±0.36*PC低劑量組 50 22.30±1.80▲ 3.48±1.02 2.29±0.40 PC中劑量組 100 18.10±1.49▲ 4.65±0.78▲ 2.45±0.31 PC高劑量組 200 14.15±2.22▲ 5.13±0.71▲ 3.06±0.24▲

3 討論

大鼠大腦中動脈的解剖分布及基底節的血液供應與人類相似,本實驗中使用大鼠局灶性腦缺血模型模擬人類腦缺血時的血流再通情況,并對方法稍加改進,將栓線由頸外動脈插入改為由頸總動脈插入,并將栓線頭部用蚊香燒成圓球狀,以減少對血管內皮細胞和血管壁的損傷,操作方便,成本低廉,成功率高,更接近于人類局灶腦缺血后的病理狀態。實驗中對腦缺血大鼠進行神經行為學評分,可作為篩選模型制備的成功與否,又可反映腦缺血損傷的病理生理過程。

在腦組織缺血缺氧時,無氧糖酵解增強,生成大量的乳酸,使組織內的p H值降低或產生酸中毒,導致細胞周圍H+增高,后者又可促發 Na+-H+交換,使更多的 Na+流入細胞內,加重細胞水腫。此外,認為高濃度H+可使蛋白質變性,并改變了那些p H依賴性酶的活性,抑制NADH的再氧化和神經遞質的再攝取,促使自由基的形成。高濃度的H+還可使溶酶體通透性增加,甚至破裂引起了溶酶體中水解酶的釋放,加重了神經元的損傷。有研究表明,腦缺血(再灌注)時組織中乳酸濃度的高低與腦組織損傷的程度呈正相關[10]。

腦的代謝完全依賴于血液中氧供及能量的及時恢復,大腦血流量的中斷,能量貯存枯竭能夠導致急性代謝紊亂。能量代謝的主要產物ATP的缺失是導致細胞死亡的關鍵因素。而ATP是維持Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase離子泵的主要能源,在腦缺血再灌注損傷時,腦組織內ATP含量的不足,使 Na+-K+ATPase和 Ca2+ATPase活性受到嚴重抑制。現代研究表明,Na+-K+-ATPase對缺血再灌注損傷十分敏感,其損傷與再灌注期間的病理改變有密切的關系,Na+-K+-ATPase活性的降低可導致神經細胞內外Na+和K+梯度不能維持,引起細胞內 Na+增多,使細胞膜除極,從而引起鈣內流及谷氨酸受體介導的一系列損傷機制的相繼發生,也是再灌注早期腦水腫形成的原因之一;同時細胞外K+增多,可使細胞膜持續去極化而影響興奮傳導、遞質釋放等,并且與缺血期間所發生的細胞自殺現象相關,影響腦恢復的質量[11]。

Ca2+-A TPase主要調節細胞內外的鈣離子平衡,當其活性降低時,細胞內的Ca2+增多,引起鈣超載現象,導致神經損傷機制的發生。因此,保護再灌注期間Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性對阻抑腦再灌注損傷的發生和發展有重要意義。

本研究中,在腦缺血期間,大鼠的神經行為學評分值升高,腦水腫加強,乳酸的含量增加,Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性降低,而使用PC能夠保護神經功能,降低腦水腫的發生,降低乳酸含量,增加Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性,尤其是使用100、200 mg/kg PC劑量時效果較為顯著。以上結果表明,PC可有效減輕大鼠腦缺血-再灌注的損傷,從而發揮神經保護作用,其機制可能與其減輕腦水腫、改善腦組織的代謝障礙有關。

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