四氯化碳復合、梯段用藥法制備大鼠門脈高壓模型的研究

徐義軍 王超

(1.湖北省京山縣人民醫院普外1科 湖北荊門 448000;2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院膽胰外科 湖北武漢 430030)

大鼠門脈高壓實驗模型對研究該病的發生、發展、轉歸以及治療具有著重要價值。自1936年Cameron和Karunaratn～e首次報道應用四氯化碳(CCl4)制作肝硬變門脈高壓動物模型至今,人們對該法不斷探索、改進和完善。基于此目的,我們對傳統的制作方法進行改良,即采用復合法、分段用藥,以求建立一種更加成熟、穩定可靠的模型制作方法,為進一步實驗打下堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 普通雄性SD大鼠(華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供)150g～170g/只,共95只。按編號法隨機分為模型對照組(n=10)以及模型組(n=85)。

1.1.2 主要試劑 CCl4(分析純,濃度為99.5%),橄欖油,新鮮配置的2.5%磷酸緩沖戊二醛固定液(由華中科技大學同濟醫學院超微病理教研室提供),苯巴比妥鈉,速眠新Ⅱ(軍事醫學科學院軍事獸醫研究所)。

1.1.3 實驗準備 將CCl4與橄欖油溶液混合配制成40%、50%的溶液,大鼠適應性飼養,食水供應充足。溫度控制在22℃(±)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 分為兩期:誘導期和成模期[1]。(1)誘導期:實驗動物在誘導前以每升蒸餾水中含0.35g苯巴比妥鈉的溶液作為大鼠的惟一飲用水,時間為1周。飼料使用普通大鼠飼料。(2)成模期:模型組:按0.4mL/100g劑量予以背部皮下注射50%CCl4橄欖油溶液(即5份CCl4+5份橄欖油溶液,混勻),每周2次,持續4周。第5周開始改為50%CCl4橄欖油溶液,以0.5mL/100g標準背部皮下注射,每周2次,持續4周。對照組:按0.4mL/100g體重予以背部皮下注射橄欖油,每周2次,對照組給予普通飲水和飼料,頻度及劑量同實驗組。停藥2周后即可成模,即制備門脈高壓大鼠模型時間共計10周。

1.2.2 影像學檢查 抽樣部分模型大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉后進行影像學(MR、CT)檢查。

1.2.3 血流動力學指標測定 所有動物均在嚴格的無菌條件下進行手術。以1.0mL/kg體重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠[2],麻醉成功后,手術助手將大鼠以仰臥位固定于手術臺上,剃除胸腹部毛發,常規消毒鋪巾,術者穿手術衣,作劍突下正中切口約3cm,推開肝葉暴露門靜脈主干,使用游標卡尺量取門靜脈主干外徑(D),注意手法輕揉,勿牽拉門靜脈,以減少誤差,結果以mm表示。暴露脾臟,將21G針頭用肝素鹽水沖洗后,刺入脾臟髓質,連接壓力換能器和生理記錄儀,以脊柱前緣為零點,間接測量門靜脈壓力(PVP),結果以mmHg表示。

1.2.4 肝臟病理學檢查 取新鮮肝臟組織以2.5%磷酸緩沖戊二醛固定后送超微病理檢查,以福爾馬林溶液固定送HE、Masson染色檢查。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 模型檢驗及存活情況

大部分實驗動物在誘導過程中活動減少,精神萎靡,食欲不振,每日引水約25mL,對外界刺激反應遲鈍,動物皮膚無光澤,腹水明顯,體重下降;同期正常對照組大鼠飲食、精神和活動狀態良好,;模型組大鼠CT、MR檢查及肉眼觀見大鼠體形消瘦,肝臟體積縮小,表面凹凸不平,脾臟略有增大,伴有肝周少量腹水;模型結束后存活61只大鼠,死亡率(28%,24/85)。

2.2 肝臟病理學改變

模型對照組HE染色見肝小葉結構完整,肝索排列整齊,肝細胞形態正常,Masson染色見匯管區無纖維組織增生,肝中央靜脈周和肝血竇周偶見少量的網狀纖維。模型組大鼠的肝組織發生了一系列病理學改變,可見炎性細胞浸潤,纖維組織廣泛增生,并破壞了肝小葉正常結構,并將其分割成大小不一、圓形或類圓形的肝細胞團,形成假小葉和小結節性肝硬變,但肝細胞再生不明顯;電鏡觀察見肝細胞腫脹變性、壞死,粗面內質網短、小,肝竇間隙內充滿大量膠原纖維,巨嗜細胞活化。

2.3 門靜脈血流動力學指標變化

門脈高壓模型組大鼠門靜脈壓力(PVP)、門靜脈內徑(D)較對照組明顯增加(P<0.05),見表1。

3 討論

肝硬化門脈高壓動物模型在研究該病的發生、發展、轉歸以及治療等方面的重要性是不言而喻的。CCl4誘發肝硬化門脈高壓動物模型是一個較為經典的方法,染毒方法有經消化道、皮下注射或腹腔內注射等途徑[3～4]。以使用小動物如大鼠為多,物模型較為穩定、可靠。為加快成模速度,可配合應用酶誘導劑,如乙醇、苯巴比妥等。1981年Chatamra采用50%CCl4、10%乙醇為主的多因素綜合法來誘導大鼠肝硬化模型,誘導時間約12周,目前已成為一種標準的誘導方法。乙醇能增強CCl4毒性作用,且能直接損傷肝細胞線粒體。但也有作者認為該方法存在一定的缺陷,如動物模型形成周期長(12周)、形成率低(低于80%),部分大鼠還出現拒飲乙醇水導致脫水乃至死亡,因各種原因導致的死亡率甚至可超過30%。苯巴比妥可使細胞色素P-450活性增強,滑面內質網增生。細胞色素P-450是肝微粒體最重要的藥物代謝酶,故合用苯巴比妥可增加肝細胞對CCl4的敏感性。在飲用水中加入苯巴比妥鈉可促進大鼠產生持久的肝硬化。復合法動物肝硬化門靜脈高壓模型是目前最常用方法,可節約時間,提高成模率與降低死亡率。

表1 門靜脈血流動力學指標

在此研究中,筆者先對實驗大鼠進行苯巴比妥誘導,再對CCl4的用藥濃度進行改進調整,即先用40%CCl4誘導4周,使大鼠對誘導藥物產生一個耐受過程,再提高CCl4的濃度至50%,為了提高CCl4的吸收率同時并不增加急性中毒死亡率,以及不對后面的研究造成干擾,故采用皮下注射方法,共選擇了85只SD大鼠,到第10周造模成功。我們通過HE染色、Masson三色染色證明,增生的纖維組織破壞了肝小葉正常結構,并將其分割成大小不一、圓形或類圓形的肝細胞團,形成假小葉和小結節性肝硬變,但肝細胞再生不明顯。肝界板破壞,纖維條索向肝內延伸、分隔,亦壓迫肝竇,使肝竇水平的阻力增高,從而引起門靜脈系統血流動力學的改變。本研究通過對門靜脈系統血流動力學的研究發現,門靜脈直徑增加,自由門靜脈壓力增高,實驗組明顯高于對照組。

綜上所述,本實驗成功地制備了大鼠肝硬化門脈高壓模型,具有典型的肝組織學改變、明顯的門靜脈系統血流動力學改變。為以后的實驗研究打下了基礎。

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